Vi beskriver bruk av perfluorodecalin som et infiltrerende montering medium. Dette er en enkel metode for å forbedre dybde bildebehandling i<em> Arabidopsis thaliana</em> Blad vev med minimal fysiologisk effekt.
Problemet med å skaffe høyoppløselige bilder dypt inn biologiske prøver er allment anerkjent 1. I luftfylte vev som svampete mesophyll av plante løv eller virveldyr lungene ytterligere vansker oppstå fra flere overganger i brytningsindeks mellom cellulære komponenter, mellom celler og luftrom og mellom biologisk vev og resten av det optiske systemet. Videre brytningsindeks uoverensstemmelser føre til demping av fluoroforen eksitasjon og signal utslipp i fluorescens mikroskopi. Vi beskriver her anvendelsen av perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), som et infiltrerende tenkelig medium som optisk forbedrer laser scanning konfokalmikroskopi (LSCM) prøve bildebehandling i dypet, uten å ty til skade øker i laser kraft og har minimal fysiologisk innvirkning to. Vi beskriver protokollen for bruk av PFD med Arabidopsis thaliana blad vev, som er optisk kompleks som et resultat av sinstruktur (figur 1). PFD har en rekke egenskaper som gjør den egnet til denne bruken 3. Den brytningsindeks PFD (1.313) er sammenlignbar med vann (1.333) og er nærmere at av cytosol (ca. 1,4) enn luft (1.000). I tillegg er PFD lett tilgjengelig, ikke-fluorescerende og er ikke giftig. Den lave overflatespenningen i PFD (19 dynes cm -1) er lavere enn vann (72 dynes cm -1) og også under grenseverdien (25-30 Dyne cm -1) for stomatal penetration 4, som gjør at det flom spongy mesophyll luftrom uten bruk av en potensielt ødeleggende vakuum eller surfactant. Endelig og avgjørende, har PFD stor kapasitet for oppløsning CO 2 og 2 O, som lar gassutveksling å bli opprettholdt i den oversvømte vev, og dermed minimere fysiologiske innvirkning på prøven. Disse egenskapene har blitt brukt i ulike applikasjoner som inkluderer delvis flytende puste og lunge inflasjon 5,6, kirurgi 7, kunstig blod 8, oksygenering av vekstmedier 9, og studier av iskrystall dannes i planter 10. Foreløpig er det vanlig å montere vev i vann eller med vannholdige buffer for live confocal imaging. Vi anser at bruk av PFD som montering medium representerer en forbedring på eksisterende praksis og gir en enkel tilberedelse av levende hele blad prøver for imaging.
Dette er en enkel og lett å bruke teknikken til å forbedre mikroskopi av luftfylte eller optisk komplekse vev. Vi har vist at teknikken har noen sterke fordeler og vi håper at det vil bli brukt til å belyse biologisk spørsmål knyttet til luft-rike vev. For eksempel ville det være et naturlig valg for studier av patogen angrep i anlegget mesophyll eller i lungene. Vi er også klar over begrensningene av teknikken. Vi jobber med bedre brytningsindeks matching, bruk med andre former for mikroskopi, og perfluorocarbon mountant påfyll under lange tidsskala eksperimenter. Vi erkjenner også, men at en av de viktigste fordelene av PFK, nemlig å være biologisk inert har en flipside. PFK ikke lett oppløse biologiske molekyler som også innebærer at de ikke lett kan brukes til å levere forbindelser av interesse, slik som hormoner, narkotika og andre små molekyler eller ioner.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke professor Nicholas Smirnoff av University of Exeter for hans råd og University of Exeter Bioimaging Facility. Finansieringen ble gitt av den britiske Bioteknologi og Biological Sciences Research Council (tilskudd referanse BB/E002682/1).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |