Summary
Descriviamo l'uso di perfluorodecalin come mezzo infiltrante di montaggio. Questo è un metodo semplice per migliorare la profondità delle immagini in
Abstract
Il problema di acquisizione di immagini ad alta risoluzione in profondità in campioni biologici è ampiamente riconosciuto 1. In aria piena di tessuti come il mesofillo spugnoso di foglie delle piante o dei polmoni dei vertebrati ulteriori difficoltà derivano da transizioni multiple in indice di rifrazione tra i componenti cellulari, tra le celle e spazi aerei e tra il tessuto biologico e il resto del sistema ottico. Inoltre, discordanze indice di rifrazione portare ad attenuazione di eccitazione fluoroforo ed emissione del segnale in microscopia a fluorescenza. Descriviamo qui l'applicazione della perfluorocarburo, perfluorodecalin (PFD), come mezzo di imaging ottico infiltrativa che migliora la microscopia confocale a scansione laser (LSCM) immagini campione in profondità, senza ricorrere ad aumenti di danneggiare in potenza del laser e ha un minimo impatto fisiologico 2. Noi descriviamo il protocollo per l'utilizzo del PFD con il tessuto foglia Arabidopsis thaliana, che è otticamente più complesse a causa della suastruttura (Figura 1). PFD ha una serie di attributi che lo rendono adatto per questo uso 3. L'indice di rifrazione di PFD (1,313) è paragonabile a quella dell'acqua (1.333) ed è più vicina a quella del citosol (circa 1,4) rispetto all'aria (1.000). Inoltre, PFD è prontamente disponibile, non fluorescente e non è tossico. La bassa tensione superficiale di PFD (19 dyne cm -1) è inferiore a quella dell'acqua (72 dyne cm -1) e anche al di sotto del limite (25 - 30 dyne cm -1) per la penetrazione stomatica 4, che permette di inondare gli spazi aerei mesofillo spugnoso senza l'applicazione di un vuoto potenzialmente distruttivi o tensioattivo. Infine e soprattutto, PFD ha una grande capacità di dissoluzione di CO 2 ed O 2, che consente lo scambio di gas deve essere mantenuta nel tessuto invaso, minimizzando così l'impatto fisiologico sul campione. Queste proprietà sono state utilizzate in varie applicazioni che includono parziale respiro liquido e del polmone inflazionezione 5,6, chirurgia 7, sangue artificiale 8, ossigenazione della crescita dei media 9, e gli studi di formazione di cristalli di ghiaccio nelle piante 10. Attualmente, è comune a montare il tessuto in acqua o in tampone acquoso per vivere l'imaging confocale. Riteniamo che l'uso di PFD come un mezzo di montaggio rappresenta un miglioramento rispetto alla pratica esistente e consente la semplice preparazione di live campioni foglia intera per l'imaging.
Protocol
Il protocollo indicati di seguito descrive un metodo semplice per l'utilizzo di PFD come mezzo infiltrativa di montaggio in foglie di Arabidopsis thaliana, ma possiamo anticipare che questo metodo può essere utilizzato in una varietà di applicazioni di imaging in cui si desidera l'aria ricca di tessuti.
1. Campioni di foglie di montaggio in PFD
- Preparare un vetrino da microscopio con un gas-permeabili guarnizione di polidimetilsilossano (PDMS, Carolina Gel di osservazione). PDMS è un polimero viscoelastico e può essere modellata per fornire una camera di misura per esigenze sperimentali.
- Equilibrare PFD con l'aria. Ciò può essere ottenuto facendo gorgogliare aria o agitando un piccolo volume di PFD in un aria piena di bottiglia.
- Decantare PFD in un piatto aperto Petri e galleggiare una piantina intera o foglia asportato il PFD per 5 minuti. Il tessuto deve diventare trasparente, che ricorda di tessuto vetrificato (Figura 2 (a)). Le foglie possono apparire più scura o più chiara rispetto a prima esposizione a PFD, dipendenzading in condizioni di illuminazione e l'età dei tessuti utilizzati.
- Riempire la camera di PDMS di aria equilibrato PFD e con attenzione trasferire i campioni di tessuto dal piatto di incubazione Petri alla camera di PDMS. Sigillare il vetrino con un coprioggetto e l'immagine a seconda delle esigenze sperimentali.
- Nota: PFD funzioni anche bene in una camera aperta costruita su un vetrino o in una camera di perfusione ed è compatibile con grasso al silicone. PFD non è compatibile con i componenti in Teflon, come li dissolve.
2. Rappresentante dei risultati:
Ispezione al microscopio di PFD-incubate campioni di foglie dimostra che la maggior parte di spazi aerei sono inondate. Figura 2 (b) mostra spazi aerei inondato di ricombinanti GFP sospeso in PFD. E 'evidente che la foglia è invaso su incubazione con PFD, ma che occasionalmente sacche d'aria può rimanere. L'acqua non inondare la foglia in queste condizioni. LSCM dei campioni incubati e montato in una ir, acqua o spettacoli PFD PFD che dà un vantaggio per l'acqua e l'aria nella profondità delle immagini possibili (Figura 3). L'esempio riportato in Figura 3 mostra Arabidopsis aria, acqua e PFD montato lascia esprimere cytosolically localizzato Venere, una variante di YFP 11 che si esprime costitutivamente sotto il promotore 35S. Possiamo vedere di circa 2 volte maggiore profondità delle immagini quando si confrontano PFD e acqua. Va notato, tuttavia, che il miglioramento preciso visto quando si usa PFD varia con apertura numerica della lente e il tipo di tessuto utilizzato. Abbiamo visto in streaming citoplasmatici e capelli allungamento radice in PFD piantine trattate, ognuno indicativo di piante sane. Inoltre abbiamo dimostrato che 2 Fv / Fm, una misura del funzionamento di fotosintesi delle piante 12 rimane entro limiti tollerabili su scale temporali utilizzati nella diagnostica per immagini.
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Figura 1. Impianto di complessità e le implicazioni foglia ottica
Diagrammatical rappresentazione che mostra le caratteristiche anatomiche della A. foglia thaliana in relazione al set-up ottico. Abbreviazioni usate sono obj. = Lente dell'obiettivo, imm. = Fluido immersione, cov. = Coprioggetti, mnt. = Montaggio, taglio. = Cuticola, annuncio. ep. = Epidermide adaxial, st. = Poro stomatica, sp. = Mesofillo spugnoso, come = spazio aereo, amico. = Palizzata mesofillo, vb = fascio vascolare, annuncio. ep. = Epidermide adaxial. Pareti cellulari sono indicati da linee nere.
Figura 2. PFD penetra facilmente foglie di Arabidopsis
(A) Foglie incubate in aria, acqua o PFD per 5 minuti e ripreso con una fotocamera digitale Leica DCF3000FX con un microscopio Leica MZ16F (Leica Microsystems (UK) Ltd., Milton-Keynes, UK). Il logo Giove era stampato su pellicola di acetato ed illuminato indietrom al di sotto con una scatola di luce. Tempo di esposizione è stato di 89 ms e tutte le immagini sono stati raccolti e trattati in modo identico. Barre di scala rappresentano 2 mm.
(B) PFD portando ricombinante purificata proteina verde fluorescente (GFP), delimita spazi aerei in vivo. GFP è falso colore verde e rosso è usato per mostrare l'auto-fluorescenza della clorofilla, che delimita le cellule del mesofillo. (Figura 2 (b) riprodotto con il permesso e tutti i dettagli tecnici disponibili in Littlejohn et al. 2010 2). Barre di scala rappresentano il 25 m.
Figura 3. PFD migliora l'imaging confocale in foglie
Immagini che mostrano LSCM cytoplasmically localizzato Venere fluorescenza (verde) e autofluorescenza della clorofilla (rosso) in A. thaliana lascia intatto ripreso in aria, acqua o PFD. Lunghezza d'onda di eccitazione è 514 nm ed emissione di fluorescenza è stato registrato a 518 nm 604 nm per Venere e at 657 nm679 nm per cloroplasti. Ogni pannello è un'unica sezione confocale preso da una pila di Z-11 immagini acquisite confocale a intervalli di 5 micron. Questi sono stati estratti da un pieno Z-stack di 59 immagini acquisite ad intervalli di 1 micron, che sono stati usati per produrre film supplementari. Misure di profondità sono date relativamente alla superficie epidermica. Immagini rappresentative, che sono stati trattati in modo identico, vengono visualizzati. Dettagli sperimentali come le impostazioni microscopio sono identiche a quelle trovate in Littlejohn et al., 2010 2. Scalebars rappresentano il 20 micron.
Discussion
Questa è una tecnica semplice e facile da usare per migliorare la microscopia di aria riempita o otticamente complessi tessuti. Abbiamo dimostrato che la tecnica presenta alcuni vantaggi forte e speriamo che possa essere utilizzato per chiarire questioni biologiche riguardanti l'aria ricca di tessuti. Per esempio sarebbe una scelta naturale per gli studi di attacco patogeno in mesofillo pianta o nei polmoni. Siamo anche consapevoli dei limiti della tecnica. Stiamo lavorando su una migliore corrispondenza indice di rifrazione, l'uso con altri modi di microscopia, e la ricarica perfluorocarburo montaggio durante lunghi esperimenti tempi. Siamo anche consapevoli, però, che uno dei vantaggi principali di PFC, cioè di essere biologicamente inerte è uno rovescio della medaglia. PFC non si dissolvono rapidamente molecole biologiche che implica anche che non possono essere facilmente usati per fornire composti di interesse come gli ormoni, farmaci e altre piccole molecole o ioni.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Nicola Smirnoff dell'Università di Exeter per i suoi consigli e l'Università di meccanismo di Bioimmagini Exeter. Il finanziamento è stato fornito dal Regno Unito Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council (sovvenzione di riferimento BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
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