Imaging neuronale responsen bij Slice Bereidingen van Vomeronasal Het uiten van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor
Summary
De vomeronasale orgaan (VNO) detecteert intraspecies chemische signalen dat de sociale en reproductieve informatie over te brengen. Wij hebben Ca2 + imaging experimenten met transgene muizen die G-CaMP2 in VNO weefsel. Deze aanpak stelt ons in staat om de ingewikkelde reactie patronen van de vomeronasale neuronen te analyseren om een groot aantal feromonen stimuli.
Abstract
De vomeronasale orgaan (VNO) detecteert chemosensory signalen dat de informatie over de sociale, seksuele en reproductieve status van de individuen binnen dezelfde soort 1,2 dragen. Deze intraspecies signalen, de feromonen, maar ook signalen van een aantal roofdieren 3, activeert u de vomeronasaal sensorische neuronen (VSNs) met een hoge specificiteit en sensitiviteit 4. Ten minste drie verschillende families van G-eiwit gekoppelde receptoren, V1R, V2R en FPR 5-14 worden uitgedrukt in VNO neuronen tot de detectie van de signalen chemosensory bemiddelen. Om te begrijpen hoe feromoon informatie wordt gecodeerd door het VNO, is het essentieel om de reactie profielen van de individuele VSNs analyseren verschillende stimuli en de specifieke receptoren die deze reacties bemiddelen identificeren.
De neuroepithelia van VNO zijn ingesloten in een paar vomer botten. De semi-blinde buisvormige structuur van VNO heeft een open einde (de vomeronasale kanaal) verbinding te makende neusholte. VSNs het uitbreiden van hun dendrieten naar het lumen van het VNO, waar de feromonen aanwijzingen in contact komen met de receptoren tot expressie gebracht in de dendritische knoppen. De cellichamen van de VSNs formulier pseudo-gelaagde lagen met V1R en V2R uitgedrukt in de apicale en basale lagen respectievelijk 6-8. Verschillende technieken zijn gebruikt om reacties van VSNs op zintuiglijke prikkels 4,12,15-19 monitor. Onder deze technieken, acute slice voorbereiding biedt verschillende voordelen. De eerste, in vergelijking met gedissocieerde VSNs 3,17, snijd de voorbereidingen onderhouden van de neuronen in hun eigen morfologie en de dendrieten van de cellen blijven relatief intact. Ten tweede, de cellichamen van de VSNs zijn gemakkelijk bereikbaar in het coronale deel van het VNO aan elektrofysiologie studies en imaging-experimenten laten in vergelijking met de gehele epitheel en hele-mount voorbereidingen 12,20. Ten derde, kan deze methode worden gecombineerd met moleculaire klonering technieken receptor identificatie mogelijk te maken.
Sensorische stimulatie ontlokt sterke Ca 2 + influx in VSNs dat indicatief is voor receptor activatie 4,21. We dus ontwikkelen van transgene muizen die express G-CaMP2 in de olfactorische sensorische neuronen, inclusief de VSNs 15,22. De gevoeligheid en de genetische aard van de sonde veel gemakkelijker Ca 2 + imaging experimenten. Deze methode heeft weggenomen de kleurstof laad-proces dat wordt gebruikt in eerdere studies 4,21. We hebben ook gebruik van een ligand levering systeem dat de toepassing van verschillende stimuli in staat stelt om de VNO plakken. De combinatie van de twee technieken stelt ons in staat gelijktijdig te volgen meerdere neuronen in reactie op een groot aantal stimuli. Tot slot hebben we een semi-geautomatiseerde analyse pijpleiding naar beeldverwerking te helpen.
Protocol
Discussion
De meerderheid van de vomeronasaal receptoren (VRS) blijven als weesreceptoren sinds hun ontdekking door Dulac en Axel 5. Het feromoon liganden voor deze chemosensory receptoren en hun rol in het bemiddelen van dieren gedrag niet goed begrepen. Tot nu toe heeft slechts een paar van ligand / receptor, de ESP1 peptide en zijn verwante receptor, Vmn2r116 (V2Rp5), geïdentificeerd en aangetoond dat specifieke sociale informatie 19,23 over te brengen. Een andere receptor, V1rb2, is aangetoond om te reag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Andrea Moran samen met leden van Lab Animal Service Facility (LASF) op Stowers Instituut voor hun uitstekende ondersteuning op de veeteelt en de technische diensten. Dit werk wordt ondersteund door de financiering van de Stowers Instituut en de NIH (NIDCD, toont 008003) om te huilen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institute on Doofheid en andere communicatie-stoornissen of de National Institutes of Health. Amerikaanse patent is aangevraagd voor de Teto-G-CaMP2 muizen voor Stowers Instituut, huilen en LM.
References
- Birch, M. C. . Pheromones. , (1974).
- Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , (2003).
- Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
- Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
- Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
- Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
- Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
- Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
- Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
- Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
- Rodriguez, I., Punta, D. e. l., Rothman, K., Ishii, A., T, ., Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
- He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
- Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
- Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
- Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
- He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
- Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
- Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
- Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
- Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
- Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
