Velge og isolere kolonier av menneskeskapte pluripotent stamceller omprogrammert fra voksne Fibroblaster
Summary
Vi presenterer en protokoll for effektiv omprogrammering av humane somatiske celler inn i menneskeskapt påvirkning pluripotent stamceller (hiPSC) bruker retrovirale vektorer som koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) og identifisering av korrekt omprogrammeres hiPSC av levende farging med Tra- 1-81 antistoff.
Abstract
Heri vi presentere en protokoll for omprogrammering voksent menneske fibroblaster inn menneskeskapt påvirkning pluripotent stamceller (hiPSC) bruker retrovirale vektorer som koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) i nærvær av natrium butyrate 1-3. Vi brukte denne metoden for å omprogrammere sent passasje (> P10) voksent menneske fibroblaster derivert fra Friedreich er ataksi pasient (GM03665, Coriell Repository). Den omprogrammering tilnærming inkluderer svært effektiv transduksjon protokollen ved hjelp av repeterende sentrifugering av fibroblaster i nærvær av virus-holdige medier. De omprogrammeres hiPSC kolonier ble identifisert ved hjelp av levende farging for Tra-1-81, en overflate markør for pluripotent celler, atskilt fra ikke-omprogrammeres fibroblaster og manuelt passaged 4,5. Disse hiPSC ble deretter overført til Matrigel plater og vokst i mater-frie forhold, direkte fra omprogrammering plate. Fra den første gangen, hiPSC kolonier demonstrere karakteristiske HMS-lIke morfologi. Ved hjelp av denne protokollen mer enn 70% av utvalgte kolonier kan være vellykket utvidet og etablert i cellelinjer. De etablerte hiPSC linjene vises karakteristiske pluripotency markører inkludert overflatevann markører TRA-1-60 og SSEA-4, samt kjernefysiske markører Oct3 / 4, Sox2 og Nanog. Protokollen som presenteres her er etablert og testet med voksne fibroblaster hentet fra Friedreich sine ataksi pasienter og kontroll enkeltpersoner 6, menneskelige nyfødte fibroblaster, samt menneskelige keratinocytter.
Protocol
Discussion
Studerer menneskelige sykdommer, spesielt nevrologiske og nevrodegenerative, har vært spesielt utfordrende på grunn av utilgjengelighet av tilstrekkelige menneskelige mobilnettet modeller. Muligheten til å omprogrammere lett tilgjengelig somatiske celler til induserte pluripotent stamceller og potensialet for å skille dem i forskjellige celletyper åpnet en mulighet for å lage cellulære modeller av genetiske sykdommer. I tillegg iPSCs holder en meget lovende i fremtiden av regenerativ medisin. Derfor er det viktig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Friedreich sin Ataksi Forskning Alliance og en pilot stipend fra Arnold Family Foundation og The Center for Stem Cells og utviklingsbiologi ved MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 11965 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
| KSR | Invitrogen | 10828 |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
| Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
| SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
| Objective marker | Nikon | MBW10010 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
| Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
| polybrene | Sigma | H9268 |
| Object marker | Nikon | MBW10010 |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich’s ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O’Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A., Lanza, R. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. , 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
