Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado
Summary
Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.
Abstract
Apresentamos aqui um protocolo de reprogramação fibroblastos humanos adultos em humanos células pluripotentes induzidas estaminais (hiPSC) utilizando vectores retrovirais que codificam OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) na presença de butirato de sódio 1-3. Usamos este método para reprogramar passagem tardia (> p10) fibroblastos humanos adultos provenientes de paciente ataxia de Friedreich (GM03665, Coriell Repository). A abordagem de reprogramação inclui protocolo de transdução altamente eficiente utilizando centrifugação repetitiva de fibroblastos na presença de vírus que contêm meios de comunicação. As colónias hiPSC reprogramadas foram identificadas utilizando imunomarcação vivo para Tra-1-81, um marcador de superfície de células pluripotentes, separados a partir de fibroblastos não-reprogramadas e manualmente passadas 4,5. Estes hiPSC foram então transferidas para placas de Matrigel e cultivadas em condições isentas de alimentação, directamente a partir da placa de reprogramação. A partir da primeira passagem, as colónias hiPSC demonstrar característica HES-lmorfologia ike. Usando este protocolo mais do que 70% das colónias seleccionadas pode com sucesso ser expandido e estabelecido em linhas celulares. As linhas estabelecidas hiPSC exibido característicos marcadores de pluripotência incluindo marcadores de superfície TRA-1-60 e SSEA-4, bem como marcadores nucleares OCT3 / 4, Sox2 e Nanog. O protocolo apresentado aqui tenha sido estabelecida e testadas usando fibroblastos adultos obtidos a partir de pacientes com AF e indivíduos de controlo 6, fibroblastos humanos recém-nascidos, bem como queratinócitos humanos.
Protocol
Discussion
O estudo de doenças humanas, especialmente neurológicas e neurodegenerativas, foi particularmente difícil devido à falta de acesso aos humanos adequados modelos de celulares. A capacidade de reprogramar células somáticas de fácil obtenção em células tronco pluripotentes induzidas e potencial para diferenciá-las em diversos tipos celulares abriu uma possibilidade de criar modelos celulares de doenças genéticas. Além disso, iPSCs realizar uma grande promessa para o futuro da medicina regenerativa. Portanto, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Aliança de Friedreich Ataxia Research e uma subvenção piloto da Família Arnold Foundation e O Centro de Células-Tronco e Biologia do Desenvolvimento no MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 11965 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
| KSR | Invitrogen | 10828 |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
| Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
| SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
| Objective marker | Nikon | MBW10010 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
| Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
| polybrene | Sigma | H9268 |
| Object marker | Nikon | MBW10010 |
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