Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.
Abstract
Hier präsentieren wir ein Protokoll der Reprogrammierung erwachsener Mensch menschlichen Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) in Gegenwart von Natriumbutyrat 1-3. Wir verwendeten diese Methode, um spät Passage neu zu programmieren (> P10) humanen adulten Fibroblasten von Friedreich-Ataxie Patienten abgeleitet (GM03665, Coriell Repository). Die Umprogrammierung beinhaltet hoch effiziente Transduktion Protokoll unter Verwendung von Fibroblasten wiederholte Zentrifugation in Gegenwart von Virus-enthaltenden Medien. Die modifizierte hiPSC Kolonien identifiziert wurden unter Verwendung lebender Immunfärbung für Tra-1-81, ein Oberflächenmarker von pluripotenten Zellen, aus nicht-programmiert Fibroblasten getrennt und manuell passagiert 4,5. Diese hiPSC wurden dann auf Matrigel Platten übertragen und aufgewachsen in Feeder-freien Bedingungen, direkt aus der Umprogrammierung Platte. Ab dem ersten Durchgang, demonstrieren hiPSC charakteristische Kolonien hES-like Morphologie. Unter Verwendung dieses Protokolls mehr als 70% der ausgewählten Kolonien erfolgreich ausgeweitet und festgesetzt werden, in Zelllinien. Die etablierten hiPSC Linien angezeigt charakteristischen Markern für Pluripotenz einschließlich Oberflächenmarker TRA-1-60 und SSEA-4, sowie nukleare Marker Oct3 / 4, Sox2 und Nanog. Das hier vorgestellte Protokoll wurde eingerichtet und getestet mit adulten Fibroblasten von Friedreich-Ataxie Patienten und Kontrollpersonen 6, menschlichen Neugeborenen Fibroblasten, sowie menschliche Keratinozyten erhalten.
Protocol
Discussion
Studieren menschlicher Krankheiten, insbesondere neurologische und neurodegenerative, wurde eine besondere Herausforderung aufgrund der Unzugänglichkeit der angemessene personelle zellulären Modellen. Die Fähigkeit, leicht erhältlich Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen umprogrammieren und das Potenzial, um sie in verschiedenen Zelltypen differenzieren eröffnet die Möglichkeit, zelluläre Modelle von genetischen Krankheiten zu schaffen. Darüber hinaus halten IPSCs ein großes Versprechen für die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Friedreich-Ataxie Research Alliance und einer Pilot-Zuschuss von Arnold Family Foundation und dem Zentrum für Stammzellen und Entwicklungsbiologie am MD Anderson Cancer Center unterstützt.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 11965 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
| KSR | Invitrogen | 10828 |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
| Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
| SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
| Objective marker | Nikon | MBW10010 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
| Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
| polybrene | Sigma | H9268 |
| Object marker | Nikon | MBW10010 |
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