Live-célula de imagem de caspase-3 apoptose mediada em imortalizado culturas N19-oligodendrócitos célula usando o<em> NucView</em> Caspase-3 488 substrato. Esta técnica é aplicável para ensaios de morte celular programada em tempo real em uma variedade de tipos de células e tecidos.
O sistema nervoso central podem experimentar uma série de tensões e traumas neurológicos, que podem ter vários efeitos adversos que acabará por levar a uma redução da população neuronal e função. Axônios danificado pode liberar moléculas excitatório glutamato, incluindo potássio, ou na matriz extracelular, que por sua vez, pode produzir mais insulto e prejuízo para as células da glia de apoio, incluindo astrócitos e oligodendrócitos 8, 16. Se o insulto persistir, as células sofrem morte celular programada (apoptose), que é regulado e ativado por um número de bem estabelecida cascatas de transdução de sinal 14. Apoptose e necrose do tecido pode ocorrer após lesão cerebral traumática, isquemia cerebral e convulsões. Um exemplo clássico de regulação por apoptose é a família de cisteína-dependente aspartato-proteases dirigidas, ou caspases. Proteases ativadas, incluindo caspases também têm sido implicados na morte celular em resposta a neuro crônicadoenças degenerativas incluindo Alzheimer, Huntington, esclerose múltipla e 4, 14, 3, 11, 7.
Neste protocolo, descrevemos o uso do 488 NucView substrato caspase-3 para medir a taxa de apoptose caspase-3 mediada em imortalizado N19-oligodendrócitos culturas (OLG) celular 15, 5, após a exposição a diferentes tensões extracelular, tais como altas concentrações de potássio ou glutamato. A linhagem celular imortalizada condicionalmente-N19-OLG (representando o progenitor O2A) foi obtido de Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, e tem sido utilizado anteriormente para estudar os mecanismos moleculares de mielina expressão gênica e transdução de sinal de liderança OLG a diferenciação (por exemplo, 6, 10). Nós encontramos essa linha de células para ser robusto com respeito a transfecção com exógenos proteína básica de mielina (MBP) constrói soldados a qualquer RFP ou GFP (vermelho ou verde proteína fluorescente) 13,12. Aqui, as culturas celulares N19-OLG foram tratados com cloreto de potássio 80 mM glutamato de sódio ou 100 mM para imitar vazamento axonal na matriz extracelular para induzir a apoptose 9. Usamos um bi-funcionais substrato caspase-3 contendo uma DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 subunidade reconhecimento e um corante DNA-binding 2. O substrato rapidamente entra no citoplasma onde é clivado pela intracelular caspase-3. O corante, NucView 488 é liberado e entra no núcleo da célula onde se liga DNA e fluoresce verde a 488 nm, sinalizando apoptose. Uso do 488 caspase-3 NucView substrato permite viver de células de imagem em tempo real 1, 10. Neste vídeo, nós também descrever a cultura e transfecção de células imortalizadas N19-OLG, bem como técnicas de live-célula de imagem.
Embora este não é o único produto fluorogênico disponíveis para a detecção de apoptose, existem várias vantagens significativas para usar o NucView 488 substrato. Um dos principais benefícios é a capacidade de acompanhar a apoptose em células vivas em tempo real, enquanto a maioria dos produtos alternativos, ou requerer a lise celular ou ter permeabilidade celular pobres. Outros benefícios incluem a alta sensibilidade para caspase-3, o reconhecimento de alta permeabilidade celular, baixa citotoxicidade, e nenhuma interferência com a progressão da apoptose. O substrato também tem fluorescência de fundo baixo até que ele é clivado e entra no núcleo, o que elimina fluorescência de fundo. A seqüência de caspase-3 reconhecimento contém 3 cargas negativas e o corante DNA-binding tem uma carga positiva 2. O DEVD-NucView 488 molécula, portanto, tem uma carga líquida negativa, o que impede a ativação e ligação do corante ao DNA em células caspase onde não está ativo.
Maintaining consistência entre experimentos é necessário para ser capaz de estabelecer comparações significativas entre repetições. Um dos principais parâmetros para manter consistente é a densidade de células, como ela afeta a taxa de transfecção. Obtenção de taxas de transfecção alta em imortalizado N19-OLG culturas de células é mais difícil do que com outras linhagens de células comuns, tais como HeLa ou HEK293, e é altamente dependente de densidade, em nossa experiência 12, 13. Nossos melhores eficiências de transfecção para estas células têm sido obtidos com Fugene HD (Roche) e são normalmente cerca de 15%, mas pode chegar a mais de 30%, dependendo da construção. Contagem de células cuidado ajudará na obtenção de taxas de transfecção consistente. Também é importante para expor as células de diferentes tratamentos para o mesmo grau de estresse ambiental, particularmente quando se mede as taxas de apoptose. Especificamente, o comprimento de tempo durante o qual as células são expostas a reagentes de transfecção, ou a quantidade de exposição à luz, são importantes variáveis ambientaisveis a considerar, e deve permanecer constante em experimentos. Para nossas aplicações, descobrimos que a recolha de um grande número de campos de visão fornece uma amostra suficientemente grande para fazer comparações estatisticamente significativa [Ibidem].
The authors have nothing to disclose.
Este laboratório tem sido apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, as Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada, e da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá (MSSC). GSTs foi o destinatário de uma Studentship Doutorado da MSSC. Somos gratos a Dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) para muitas discussões úteis e comentários sobre o manuscrito. Somos gratos a Biotium por sua generosa oferta de NucView adicionais 488 caspase-3.
Table of specific reagents and equipment
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
---|---|---|
NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium | 30029 |
FuGENE HD transfection reagent | Roche | 04709705001 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 31053-028 |
0.25% Trypsin | Gibco | 15050-065 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 |
#1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 |
Chamlide CMB magnetic |
Quorum Technologies | CM-B-40 |
Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR | 82050-576 |
BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR | CA62406-161 |