Transretinal ERG Optagelser fra Mouse nethinden: Rod og Cone Photoresponses
Summary
Beskriver vi en relativt enkel fremgangsmåde til transretinal elektroretinogram (ERG) optagelser til opnåelse stang og kegle photoresponses fra intakte muse retina. Denne tilgang tager fordel af den blok af synaptisk transmission fra fotoreceptorer til at isolere deres lette svar og registrere dem ved hjælp af feltelektroder placeret over den isolerede flade monteret nethinden.
Abstract
Der er to distinkte klasser af billeddannende fotoreceptorer i hvirveldyr nethinden: stave og tappe. Stænger er i stand til at detektere en enkelt lysphotoner henviser kegler arbejde kontinuerligt under ændrer sig hurtigt klare lysforhold. Absorption af lys ved stangformede og kegle-specifikke visuelle pigmenter i de ydre segmenter af fotoreceptorer udløser en lysoverførelsen, som til sidst fører til lukning af cykliske nukleotid-gatede kanaler på plasmamembranen og celle hyperpolarisering. Dette lys-induceret ændring i membran nuværende og potentielle kan blive registreret som photoresponse, ved enten klassisk suge elektrode optagelse teknik 1,2 eller transretinal elektroretinogrammet optagelser (ERG) fra isolerede nethinder med farmakologisk blokerede postsynaptiske respons komponenter 3-5. Den sidstnævnte metode tillader lægemiddel-tilgængelige langvarige optagelser fra mus fotoreceptorer og er særlig nyttig til at opnå stabile photoresponses frOM de begrænsede og skrøbelige mus kegler. I tilfælde af kegler, kan sådanne eksperimenter kan udføres både i mørke-tilpassede betingelser og efter intens belysning, blegemidler stort set alle visuelle pigment, til overvågning af keglen lysfølsomhed opsving i løbet af mørke tilpasning 6,7. I denne video, vil vi vise, hvordan man udfører stang-og M / L-kegle-drevne transretinal optagelser fra mørke-tilpasset mus nethinden. Stangen optagelser udføres ved anvendelse retina af vildtype (C57BL / 6) mus. For nemheds skyld vil kegle optagelser opnås fra genetisk modificerede stang transducin α-underenhed knockout (Ta – / -) mus, der mangler stangen signalering 8.
Protocol
Discussion
Fremgangsmåden stangformede og kegle-drevne transretinal ERG optagelser beskrevet ovenfor bliver et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af funktionen af muse fotoreceptorer i både vildtype-og genetisk modificerede dyr. Ud over den nemme karakterisering af grundlæggende photoresponse egenskaber, giver denne simple teknik god respons stabilitet under langvarige forsøg udført på tæt-på-intakte nethinden præparater. Både mørke tilpasset stang maksimale respons amplitude og lysfølsomhed i vildtypemus er …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet af Career Development Award fra Research for at forebygge blindhed, NIH tilskud EY19312 og EY19543 (VJK), samt ved ubegrænset bevilling fra Research for at forebygge blindhed og EY02687 (Department of Ophthalmology og Visual Fakultet ved Washington University).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| DL-AP-4 | TOCRIS bioscience | 0101 | ||
| All other reagents | Sigma-Aldrich | |||
| Glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | For making electrodes | |
| Filter paper | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | For light calibration | |
| Radiometric silicon sensor | UDT Instruments | 221 | For light calibration | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | To minimize mechanical noise | |
| Air compressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | Connected to anti-vibration table | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | For mouse eye dissection | |
| Infrared image converters | B.E.Meyers | ProwlerTM | Bound to stereomicroscope | |
| Differential amplifier DP-311 |
Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | 1440A | ||
| Dual Channel 8-pole Filter | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Ceramic resistor | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | For reheating the perfusion solution | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperature monitor | Omega | DPi32 | Connected to thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics/ Optek Technology | Digi-key P/N 365-1185-ND | To apply test flashes/bleaching light | |
| Cautery pen | Bovie | AA25 | For marking the dorsal part of the mouse eyeball | |
| pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices |
References
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
- Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
