Summary

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

Published: March 14, 2012
doi:

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Abstract

ישנם שני סוגים שונים של התמונה יוצרי photoreceptors ברשתית חוליות: מוטות קונוסים. מוטות מסוגלים לזהות פוטונים בודדים של אור בעוד גביעי לפעול ברציפות תחת המשתנה במהירות בתנאי תאורה בהירים. קליטת האור על ידי מוט ו חרוט ספציפיים פיגמנטים ויזואליים של המגזרים החיצוניים של photoreceptors מפעילה מפל phototransduction שבסופו של דבר מוביל סגירת נוקלאוטיד-מגודרת ערוצי מחזורית על קרום פלזמה hyperpolarization התא. שינוי זה האור הנגרמת בקרום הנוכחי ופוטנציאל יכול להיות רשום כ photoresponse, על ידי 1,2 קלאסית האלקטרודה יניקה הקלטה לטכניקה או הקלטות electroretinogram transretinal (ERG) של הרשתית מבודדים עם חסומים פרמקולוגית רכיבים תגובה postsynaptic 3-5. השיטה השנייה מאפשרת סמים נגישים לטווח ארוך הקלטות של photoreceptors העכבר הוא שימושי במיוחד עבור קבלת photoresponses יציבים frאום את הקונוסים עכבר נדיר ושברירי. במקרה של קונוסים, ניסויים כאלה יכולים להתבצע גם בתנאי חושך, המותאמים תאורה חזקה הבאה זה עלול להלבין למעשה כל פיגמנט ויזואלי, כדי לפקח על תהליך ההתאוששות של רגישות חרוט במהלך עיבוד כהה 6,7. בסרטון הזה, אנו נראה כיצד לבצע מוט ו-M / L-חרוט מונחה הקלטות transretinal של הרשתית כהה מותאם העכבר. הקלטות רוד יבוצע באמצעות הרשתית מסוג (C57Bl / 6) עכברים בטבע. לשם הפשטות, הקלטות חרוט יהיה לקבל מהונדסים גנטית מוט transducin α-למקטע בנוקאאוט (Tα – / -) עכברים אשר חסרים מוט איתות 8.

Protocol

1. ביצוע אלקטרודות הכן אלקטרודות זכוכית. שוקל 120 מ"ג אגר ומערבבים אותו במים מזוקקים 10 מ"ל (ריכוז אגר האחרון 1.2%). ממיסים את הפתרון אגר באמבט מים חמים. מלאו כוס נימים (אנו משתמשים Presision מכשירים וורד TW100-4 נימים עם הממדים …

Discussion

שיטת מוט ו חרוט מונחה הקלטות transretinal ERG המתואר לעיל הופך כלי רב עוצמה על חקירת פונקציה של photoreceptors עכבר בסוג הן פראית בבעלי חיים מהונדסים גנטית. בנוסף לאפיון קל של נכסים photoresponse בסיסיים, טכניקה פשוטה זו מספקת יציבות בתגובה רבה במהלך לטווח ארוך ניסויים שבוצעו על קרוב אל ש…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

נתמך על ידי פרס קריירה ופיתוח ממחקר למנוע עיוורון, NIH מענקים EY19312 ו EY19543 (VJK), כמו גם על ידי מענק בלתי מוגבל של מחקר למניעת עיוורון EY02687 (מחלקת עיניים ו-Visual למדעים באוניברסיטת וושינגטון).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DL-AP-4   TOCRIS bioscience 0101  
All other reagents   Sigma-Aldrich    
Glass capillaries   World Precision Instruments TW100-4 For making electrodes
Filter paper HARG Millipore HABG01300  
Photometer   UDT Instruments S350 For light calibration
Radiometric silicon sensor   UDT Instruments 221 For light calibration
Anti-vibration table   Technical Manufacturing Corporation TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 To minimize mechanical noise
Air compressor Panther P 15TC   Werther International P 15TC Connected to anti-vibration table
Stereomicroscope   LEICA MZ9.5 For mouse eye dissection
Infrared image converters   B.E.Meyers ProwlerTM Bound to stereomicroscope
Differential amplifier
DP-311
  Warner Instruments DP-311  
Axon Digidata 1440A Digitizer   Molecular Devices 1440A  
Dual Channel 8-pole Filter   KROHN-HITE Corporation 3382  
Ceramic resistor   TE Connectivity CGS SBCHE618RJ For reheating the perfusion solution
Thermocouple T Physitemp Instruments IT-18  
Temperature monitor   Omega DPi32 Connected to thermocouple
LED 505 nm   TT Electronics/ Optek Technology Digi-key P/N 365-1185-ND To apply test flashes/bleaching light
Cautery pen   Bovie AA25 For marking the dorsal part of the mouse eyeball
pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software   Molecular Devices    

References

  1. Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
  2. Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
  3. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  4. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  5. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  6. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  7. Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
  8. Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
  9. Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
  10. Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
  11. Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
  12. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).

Play Video

Cite This Article
Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses. J. Vis. Exp. (61), e3424, doi:10.3791/3424 (2012).

View Video