RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em
Summary
Beskriver vi en sensibiliseret metode til at identificere postembryonic regulatorer af proteinekspression og lokalisering i<em> C. elegans</em> Ved hjælp af en RNAi-baseret genomisk skærm og en integreret transgen som udtrykker et funktionelt, fluorescens mærket protein.
Abstract
C. elegans har vist sig at være en værdifuld modelsystem til opdagelse og funktionelle karakterisering af mange gener og genprodukter veje 1. Mere avancerede værktøjer og ressourcer til studier i dette system er lettere fortsat opdagelsen af gener med mere subtile fænotyper eller roller.
Her præsenterer vi en generel protokol, vi er tilpasset til at identificere C. elegans gener med postembryonic fænotyper af interesse ved hjælp af RNAi 2. Denne fremgangsmåde kan let modificeres til bestemmelse af fænotype valg, hvad enten de lette eller fluorescens optik på et dissektionsmikroskop eller forbindelse mikroskop. Denne screening protokol udnytter de fysiske aktiver i organismen og molekylære værktøjer til C. elegans forskning fællesskab har frembragt. Som et eksempel viser vi anvendelse af en integreret transgen, som udtrykker et fluorescerende produkt i en RNAi skærmen for at identificere gener, der kræves for normal lokalisering af detteprodukt i sent larver og voksne. Først brugte vi en kommercielt tilgængelig genomisk RNAi bibliotek med fuld-længde cDNA skær. Dette bibliotek letter den hurtige identifikation af flere kandidater ved RNAi reduktion af kandidat-genproduktet. For det andet har vi skabt en integreret transgen som udtrykker vores fluorecently taggede protein af interesse i et RNAi-følsom baggrund. Det tredje ved at udsætte skraverede dyr RNAi, tillader dette skærmbillede identifikation af genprodukter, der har en afgørende embryonisk rolle, som ellers ville maskere en post-embryonale rolle i reguleringen af proteinet af interesse. Endelig Denne screening anvender en forbindelse mikroskop udstyret til enkelt celle opløsning.
Protocol
Discussion
RNAi screeningsmetode præsenteret her muliggør en følsom og hurtig analyse af genprodukter, der kræves for en normal (eller transgene) postembryonic fænotype. Det viste eksempel er en screening for gener involveret i den subcellulære lokalisering af en fluorescens-mærket protein. Imidlertid kan denne protokol kan modificeres til at identificere gener, der påvirker andre postembryonic fænotyper af interesse.
Denne fremgangsmåde drager fordel af en kandidat-gen fremgangsmåde ved anv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Rick Padgett (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) for gaven af DBL-1 cDNA og Dr. Christopher Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) for en injektion markør. Dr. Barth Grant laboratorium udførte genkanonen bombardement for lavt kopital integration af GFP-mærkede DBL-1-konstruktionen. Den René Garcia Laboratoriet ydet faglig bistand under oprettelsen af texIs100. Den René Garcia, Robyn Lints, og Hongmin Qin laboratorier forudsat produktiv rådgivning. Dette arbejde blev finansieret af start-up midler fra TAMHSC Institut for Molekylær og cellemedicin. Den forbindelse omfang og spinning disk konfokal blev købt med midler fra afdelingen og TAMHSC College of Medicine kontor dekanen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
References
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O’Meara, M. M., Pe’er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
