에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em
Summary
우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을 설명<em> C. elegans</em> RNAi 기반 게놈 화면과 기능, fluorescently 태그가 단백질을 표현 통합 transgene을 사용합니다.
Abstract
C. elegans는 많은 유전자와 유전자 경로 1의 발견과 기능적 특성에 대한 유용한 모델 시스템 것으로 입증되었습니다. 보다 정교한 도구와이 시스템의 연구를위한 자원이 더 미묘한 phenotypes이나 역할과 유전자의 지속적인 발견을 촉진하고 있습니다.
여기에서 우리는 C를 식별 맞게 일반화된 프로토콜을 제시 RNAi 2를 사용 흥미 postembryonic phenotypes와 elegans의 유전자. 이 절차는 쉽게 여부 해부 또는 복합 현미경의 빛 또는 형광 광학에 의해 검정 선택의 표현형으로 수정됩니다. 이 심사 프로토콜은 유기체의 물리적 자산 및 분자 도구 C.에 capitalizes elegans 연구 커뮤니티하였습니다. 예를 들어, 우리는 이것의 일반적인 로컬 라이제이션에 필요한 유전자를 식별하기 위해 RNAi 화면에 형광등 제품을 표현하는 통합 transgene의 사용을 보여줍니다늦은 무대 애벌레와 어른의 제품입니다. 첫째, 우리는 전체 길이 cDNA 삽입으로 상용 게놈 RNAi 라이브러리를 사용했습니다. 이 라이브러리는 후보 유전자 산물의 RNAi 감소하여 여러 후보자의 급속한 식별을 용이하게합니다. 둘째, 우리는 RNAi를 구분 배경에 관심이 우리의 fluorecently 태그가 단백질을 표현 통합 transgene을 올렸습니다. 셋째, RNAi에 부화 동물을 노출하여,이 화면은 특별히 관심 단백질을 규제에서 사후 배아 역할을 숨길 수있는 중요한 배아 역할을 유전자 제품의 식별을 허용합니다. 마지막으로,이 화면은 단세포 결의안에 대한 갖춘 복합 현미경을 사용합니다.
Protocol
Discussion
여기서 제시 RNAi 심사 방법은 정상적인 (또는 형질) postembryonic 표현형에 필요한 유전자 제품의 민감하고 빠른 분석을 가능하게합니다. 표시 예제 fluorescently 태그가 단백질의 subcellular 지방화에 관련된 유전자에 대한 화면입니다. 그러나,이 프로토콜은 관심사의 다른 postembryonic phenotypes에 영향을 미치는 유전자를 식별하기 위해 수정할 수 있습니다.
이 방법은 RNAi 라이브러리?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 분사 마커에 대한 dbl-1 cDNA와 닥터 크리스토퍼 Rongo (Waksman 연구소, Rutgers 대학, 뉴저지)의 선물 박사 릭 Padgett (Waksman 연구소, Rutgers 대학, 뉴저지)에 감사드립니다. 닥터 바스 그랜트의 연구실에서 GFP-태그를 dbl-1 구조의 낮은 사본 번호 통합을위한 유전자 총기 포격을 수행. 르네 가르시아 연구실 texIs100의 창출 동안 기술 지원을 제공했습니다. 르네 가르시아, 로빈의 Lints 및 Hongmin 진 실험실 생산적인 조언을 제공했습니다. 이 작품은 분자 및 세포 의학 TAMHSC학과 시동 기금에 의해 자금 지원되었다. 화합물 범위와 회전 디스크 공촛점는 부서와 딘의 의학 사무소의 TAMHSC 대학에서 제공하는 자금으로 구입했습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
References
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