MALDI الطيف الكتلي التصوير من نيوروببتيد في مرض باركنسون

Summary

الدوبامين استبدال العلاج الدوائي باستخدام لام دوبا هو العلاج الأكثر شيوعا من أعراض مرض باركنسون، لكن يرافقه من الآثار الجانبية بما في ذلك تحركات غير طبيعية غير الطوعي، وخلل الحركة ووصف¹. هنا، يتم تقديم بروتوكول للكتلة MALDI التصوير الطيفي أن يكشف تغيرات في مستويات الفئران neuropeptide الدماغ المرتبطة خلل الحركة.

Abstract

MALDI تصوير الطيف الكتلي (IMS) هو نهج القوية التي تسهل التحليل المكاني للأنواع الجزيئية في عينات الأنسجة البيولوجية ² (Fig.1). ويغطي القسم A 12 ميكرون رقيقة الأنسجة مع مصفوفة MALDI، مما يسهل والامتزاز التأين من الببتيدات سليمة والبروتينات التي يمكن الكشف عنها مع محلل الشامل، وذلك باستخدام عادة MALDI TOF / TOF مطياف الكتلة. عموما يمكن أن تقيم مئات من القمم في مقطع واحد الفئران أنسجة المخ. وعلى النقيض من تقنيات التصوير المستخدمة، وهذا النهج لا يتطلب معرفة مسبقة من الجزيئات من الفائدة ويسمح للتحليل غير خاضعة للرقابة وشاملة من الأنواع الجزيئية متعددة مع الحفاظ على خصوصية الجزيئية العالية وحساسية ^2. نحن هنا وصف نهج IMS MALDI مقرها لتوضيح ملامح التوزيع الخاصة بكل منطقة من نيوروببتيد في الدماغ الفئران من مرض حيوان نموذج الشلل الرعاش (PD).

PD هو مرض شائع الاعصاب مع انتشار قدرها 1٪ بالنسبة للأشخاص فوق سن 65 من العمر ^3،4. ويستند العلاج الأكثر شيوعا أعراض على استبدال الدوبامين باستخدام لام دوبا ^5. لكن يرافق ذلك من خلال آثار جانبية خطيرة بما في ذلك تحركات غير طبيعية غير الطوعي، ووصف لام دوبا الناجم عن خلل الحركة (غطاء) ^1،3،6. واحد من التغيير الجزيئي الأبرز في LID هو upregulation من مرنا السلائف prodynorphin الأفيونية ^7. والببتيدات dynorphin تعدل العصبي في مناطق الدماغ التي تشارك أساسا في مراقبة الحركة ^7،8. لكن، حتى الآن على وجه الدقة الببتيدات الأفيونية التي تنشأ من تجهيز السلائف neuropeptide لم يتميز. ولذلك، تستخدم نحن MALDI IMS في نموذج حيواني من مرض باركنسون والتجريبية لام دوبا خلل الحركة التي يسببها.

أثبتت MALDI التصوير قياس الطيف الكتلي ليكون من المفيد وخاصة فيما يتعلق characteriza neuropeptideنشوئها، منذ النهج الأجسام المضادة المستخدمة القائم يستهدف سلاسل الببتيد معروف سابقا، ولاحظ التعديلات بعد متعدية. على النقيض من ذلك يمكن أن MALDI IMS كشف رواية تجهيز المنتجات الببتيد، وبالتالي تكشف عن الآليات الجزيئية الجديدة من تعديل neuropeptide من انتقال الخلايا العصبية. في حين لا يمكن أن المبلغ المطلق من نيوروببتيد يحددها IMS MALDI، أن يرسم الوفرة النسبية للايونات الببتيد من أطياف الشامل، وإعطاء الأفكار حول تغيير مستويات في الصحة والمرض. في الأمثلة المعروضة هنا، تم العثور على شدة ذروة B dynorphin، ألفا neoendorphin وف المادة المراد زيادة كبيرة في ظهراني جانبي، ولكن ليس ظهراني إنسي، المخطط للحيوانات مع خلل الحركة الشديدة التي تنطوي على الوجه والجذع وعضلات orolingual (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، كشفت MALDI IMS وجود علاقة بين شدة خلل الحركة ومستويات DES-التيروزين neoendorphin ألفا، وهو ما يمثل آلية لم تكن معروفة سابقا من inacti وظيفيvation من dynorphins في المخطط مثل إزالة N-محطة التيروزين يقلل من dynorphin في مستقبلات المواد الأفيونية قدرة ملزم ^9. هذه هي أول دراسة على توصيف neuropeptide في LID باستخدام MALDI IMS، وإبراز النتائج المحتملة لهذه التقنية لتطبيقها في جميع مجالات البحوث الطبية الحيوية.

Protocol

ويتم تعديل البروتوكول لغرض التحليل الإحصائي لبيانات نظام الرصد الدولي MALDI من عدة أقسام المخ الفئران، وعادة 20-30 المقاطع، ويتكون من خمس خطوات المختلفة التي تتألف إعداد الأنسجة، وتطبيق مصفوفة، MALDI-TOF MS تحليل وتقييم البيانات، وneuropeptide تحديد الهوية. وترد الإجراءات وصفها في أكثر تفصيلا أدناه: 1. إعداد الأنسجة هذا الإجراء يشمل جمع عينات من الأنسجة لكل منها وكذلك الأنسجة باجتزاء لتحليل نظام الرصد الدولي. وثمة هدف معين في تحليل البروتين والببتيد هو تجنب تدهور بروتين. ولذلك لا بد من العمل بسرعة وجدية خلال تشريح الأنسجة. تضحية الفئران (عادة 250-300 ز) بواسطة قطع الرأس، وإزالة دماغ الفئران في غضون فترة زمنية بعد الوفاة الحد الأقصى ل30S <وتجميد الثلج الجاف المجفف قبل ان ينتقل الى التجميد -80 درجة مئوية. أسرع التجميد باستخدام النتروجين السائلتزيد من خطر microtears في أنسجة المخ، والتي سوف تؤثر سلبا على بلورة المصفوفة وبالتالي الحد من MS جودة (الشكل 2D). ويمكن تخزين أدمغة كامل لعدة سنوات قبل باجتزاء دون فقدان للجودة الإشارة MS. قطع الأنسجة المجمدة على مشراح ناظم البرد إلى شرائح ميكرون 12 و المقاطع النسيجية ذوبان جبل على موصل الشرائح الزجاجية MALDI (شرائح الإنديوم أكسيد القصدير مطلي، بروكر Daltonics) أو MALDI الهدف (الشكل 2A-C). أقسام جاف لمدة 15 دقيقة تحت فراغ والشرائح في مخزن -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. وينبغي تحليل المقاطع النسيجية في أقصر وقت ممكن بعد باجتزاء، حتى لو المخزنة في -80 درجة مئوية. نجد أنه سيتم MS جودة الإشارة خفضت بشكل ملحوظ بعد عام في التخزين. من أجل الحد من أكسدة البروتينات والببتيدات، يمكن استبدال الهواء في حاوية تخزين بغاز خامل (مثل الأرجون أو النيتروجين). 2. مصفوفة التطبيق مصفوفة التطبيقخطوة له تأثير كبير على نوعية الطيف ويتطلب تعظيم الاستفادة من معلمات متعددة اعتمادا على نوع من الأنسجة، فضلا عن تحليلها للاهتمام. وتشمل هذه العوامل الكيميائية المعلمات مثل هذا النوع من المصفوفة، وتركيز مصفوفة، ودرجة الحموضة، وغسل الأنسجة ومعدلات العضوية، فضلا عن ضبط فعال بما في ذلك حجم الودائع، وقرار الجانبية وعدد من شهادات 10 (الشكل 2D). لاجراء تجارب على نطاق واسع، فإنه من الأهمية بمكان للحد من التباين، على سبيل المثال عن طريق تطبيق مصفوفة لكافة قطاعات خلال يوم واحد من قبل المشغل نفسه. على الرغم من أن هناك العديد من الاستراتيجيات لتطبيق حل مصفوفة مثل التسامي بواسطة أو عن طريق الرذاذ، وترسب الآلي من المصفوفات مصفوفة من قطرات صغيرة، حوالي 100-150 بيكو لتر في الحجم، وقد استخدمت بنجاح لتحليل البروتينات الصغيرة ونيوروببتيد في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك أقسام الدماغ 9، 10،11، 12، 13. تذويب المقاطع في dessicator لمدة 1 ساعةلدينا. تأكد من أن أعمى التجربة من قبل شخص آخر غير مشغل. إعادة تسمية جميع العينات. غسل أقسام 1X في الايثانول 70٪ (EtOH، في درجة حرارة الغرفة، RT) لمدة 10 ثانية، ومرتين في 95٪. EtOH (RT) لمدة 10 ثانية للتجارب كبيرة، وأداء الغسيل لجميع شرائح الزجاج معا باستخدام كوفيت من أجل تقليل التباين. تجفيف المقاطع في dessicator لمدة 10 دقيقة. تقييم أقسام النسيج تحت المجهر والتحقق من تشويه النسيج، microtears والشقوق الصغيرة التي من شأنها أن تضعف MALDI MS جودة (الشكل 2D). إعداد الطازجة حل مصفوفة تتكون من 50 ملغ / مل في DHB الميثانول بنسبة 50٪، 10٪ خلات الأمونيوم 150mM (AMAC) وحامض trifluoroacetic 0.3٪ (TFA) في الماء. يتم تنفيذ مصفوفة تطبيق لترسب قطرات منفصلة في نمط المستطيل باستخدام طابعة نافثة للحبر الكيميائية (CHIP، شيمادزو). فإن الخطوة الأولى هي لتحسين المعلمات التجريبية من تطبيق مصفوفة لتحليل includi neuropeptideنغ عدد قطرات لكل تمريرة، وعدد من التمريرات. يتم تنفيذ هذه التجربة من خلال تطبيق المصفوفات مصفوفة متعددة مع تطبيق معايير مختلفة على قسم النسيج نفسه، في حين التأكد من أن كل مجموعة تغطي مناطق الدماغ مشابهة مثل الجسم الثفني، قشرة، والمخطط. نفس التجربة لابد من تنفيذها يتم تغيير كل معالم الزمن، بما في ذلك الهياكل الدماغ المختلفة، ومصفوفات مختلفة تستهدف التحاليل محددة، وإذا كان هناك حاجة لمذيبات مصفوفة مختلفة لاستخراج من analytes محدد مسح صاحب شريحة زجاجية مع قسم الأنسجة ومحاذاة حامل. تعريف الصفيف الخاص بك لتطبيق مصفوفة على قسم الأنسجة وتحديد أي قرار المكانية بقعة على الفور بعد. تطبيق مصفوفة باستخدام بروتوكول الأمثل على مادة كيميائية طابعة نافثة للحبر. لهذه التجربة استخدمنا بروتوكول الأمثل للتصوير الببتيد مع المعلمات الطباعة التالية: 10 قطرات (100 PL / قطرة)، و 10 تطبيق يمر وبقعة إلى بقعة دistance من 300 ميكرون. رصدت الفحص النهائي مصفوفة المقاطع وحفظ الصورة للتسجيل قبل الحصول على البيانات MALDI (الخطوة 3.4). تخزين المقاطع حتى استخدامها مرة أخرى في dessicator تحت فراغ. 3. MALDI الحصول على البيانات ومعالجة مرض التصلب العصبي المتعدد يتم تنفيذ MS تحليل نيوروببتيد في وقت MALDI صك الطيران (فائق المرونة الثاني، بروكر Daltonics، ألمانيا) التي تعمل في وضع العاكس، وذلك باستخدام برامج اكتساب البيانات المساعدة من كل بقعة مصفوفة واحدة 14. التدريس المكاني دقيق لذلك أمر حتمي. فمن الضروري أن يتم تنفيذ التحسين MALDI، واقتناء وخصوصا تسجيل هدف التجارب من قبل المشغل نفسه الذي يفضل أن أعمى إلى المجموعات التجريبية. في تجربة واسعة النطاق مع شرائح زجاجية متعددة، يمكن إجراء التجارب MALDI من قبل مشغل واحد بينما شخص آخر يعمل على طابعة نافثة للحبر الكيميائية. تحميل الشرائح الزجاجية في مطياف الكتلة. تحقق من معايرة طريقة اكتساب MALDI باستخدام مزيج الوزن الجزيئي المنخفض المعايرة القياسية (بروكر Daltonics). تحسين المعلمات اكتساب. من أجل تحسين MS إشارة وتجنب ablating مصفوفة من ودائع مصفوفة المجاورة، ينبغي تحديد حجم الليزر والتركيز الأمثل في الأنسجة. تم تعيين طاقة الليزر لضمان جودة MS القصوى من ودائع مصفوفة عدد ممكن من دون رفع مستوى خط الأساس، والحد من قرار قمة أو تشبع كاشف. تقييم الحد الأقصى لعدد الطلقات في بقعة مصفوفة حتى يتم الكشف عن الضوضاء فقط، وغالبا 1000-2000 الطلقات. ويقدر عدد الطلقات التي ينبغي المتراكمة وعدد من الطلقات تم الحصول عليها قبل موقف الليزر ضمن بقعة يجب تغيير. من أجل أخذ عينات من كل بقعة مصفوفة بشكل متساو، ونحن تتراكم 600 طلقات في خطوات لقطة 25، بالنسبة لعدد مجموعه 24 خطوات باستخدام RANدوم نمط من الحركة، من كل ترسب مصفوفة. سجل المسح الضوئي لجميع أبواب رصدت لإحداثيات الحركية للمرحلة MALDI باستخدام FlexImaging (V.2.0) 10، وتأدية الحصول على البيانات في دفعة واسطة من قبل البرامج AutoXexuteBatchRunner.exe. معالجة كل الأطياف واحدة عن طريق طرح خط الأساس (محدب بدن V3)، تجانس والمعايرة الخارجية (اختياري)، يليه التصدير كملف ASCII (*. دات، *. txt أو *. CSV الشكل). 15 4. بيانات التقييم نهائي بيانات التقييم يشمل تجهيز البيانات والحد من آخر البيانات من خلال التركيز فقط على المعلومات الذروة، يليه التحليل الإحصائي. وكخطوة أولية، وجرى تقييم نظام الرصد الدولي المقاطع MALDI للآثار overnormalization. وهذا يمكن تحقيقه بسهولة من خلال استخدام أدوات التصوير البيانات مثل FlexImaging (بروكر Daltonics) أو BioMap (نوفارتيس). كخطوة أولى الصور ايون هي مجموع إيفاluated قبل مجموع تطبيع ايون (TIC) الحالي، تليها التفتيش اليدوي واحد الصور توزيع الأيونات من مختلف القمم الببتيد بارز. ابحث عن خاصية توزيع كثافة الذروة، وإذا كانت تتعلق ملامح النسيج (التعويضات)، اكتشاف جودة أو تطبيع الآثار (الشكل 3) تحديد المناطق المصالح (مثل المخطط) وفقا لملامح النسيجي وتصدير الأطياف المناظرة في شكل ملف ASCII. ويفضل، ويمكن أن يؤديها تطبيع الأطياف إلى التيار ايون مجموع (TIC) في هذه المرحلة. استيراد ملفات ASCII في برامج معالجة البيانات مثل المنشأ (v.8.1، Originlab)، MATLAB (برنامج Mathworks، ناتيك، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية) أو R 16. لا يمكن أن يؤديها الكشف عن ذروة الذروة باستخدام أدوات العثور المدرجة في البرنامج، على سبيل المثال "تحليل الذروة" في الأصل أو "mspeaks" في Matlab. تصدير peaklists من جميع أطياف كملف واحد وحيد التبويب نص محدد. من أجل تحديد الحدود بن لالببتيد الكشفقمم، يتم تنفيذ تحليل binning باستخدام أدوات البرامج المناسبة (على سبيل المثال pbin 17) أو في المنزل مكتوب النصية لMATLAB أو R. هنا ملف نص واحد يحتوي على جميع البيانات الذروة التقطت يتم تحميلها في البرنامج، ويتم تحديد معايير لتحديد الحدود القصوى مثل عدد المرات ذروته يجب أن تكون موجودة في أطياف من أجل أن تكون ذات صلة للتجربة. على سبيل المثال، تجربة يحتوي على 2 مجموعات من الحيوانات، و 5 حيوانات في كل مجموعة، والأطياف 100 يتم جمع من كل حيوان والمنطقة من اهتمام. تفترض ذروة المثير للاهتمام يحتمل إذا كان موجودا في الأغلبية على الأقل من هذه الحيوانات في مجموعة واحدة (3/5)، وفيما لا يقل عن نصف أطياف تلك الحيوانات (3×50 = 150 الأطياف)، وهذا يعطي نسبة إجمالي 15٪ لطيف إيجابي 150 من مجموع الأطياف (2x5x100) 1000. باستخدام أداة pbin، هذه الخطوة ينتج ملف واحد يحتوي على جميع binrange بعرض بن لتحديد من البيانات التي يحصل عليها. من أجل التحقق من أن الحدود بنملائمة، فمن السهل تصور صناديق في الأصل مع آثار أطياف الأصلي. يمكن الذروة منطقة التكامل خفض التباين أن من المهم للتحليل الإحصائي. نحن استخدام برنامج نصي مكتوب في المنزل للبحث لحساب المنطقة تحت المنحنى بين الحدود القصوى المحددة في الخطوة 4. ويتم استيراد المناطق اندماجا في ذروة التفوق MS (v.2007) والتحليل الإحصائي عن طريق المنظمات غير حدودي الاختبار المفردة باستخدام أداة SAM يتم تنفيذ 18. 5. الببتيد تحديد تسلسل التحقق من هويات الببتيد الملاحظة أمر ضروري من أجل إبرام أهميتها البيولوجية. النهج الأكثر دقة وتشمل صحيح من أعلى إلى أسفل تقرير مباشرة من النسيج باستخدام تجزئة الببتيد بواسطة جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (MS / MS)، على الرغم من أن هناك حاجة تركيزات عالية الببتيد لهذا النوع من التحليل 12،13. لالببتيدات وفرة منخفضة أو الببتيد متعددة مع كلوسم / ض القيم (± 0.5٪)، وضعف في التحليل والنسيج ويستخدم تحليل خارج النسيج باستخدام استراتيجية peptidomic التي تشمل استخراج وفصل وتحديد مقرها MS من نيوروببتيد الذاتية. للتجربة المقدمة هنا، كان التركيز الرئيسي على الكشف عن الببتيدات المؤفينة، الذي يمثل تحديا خاصا لأن هذه الببتيدات منخفضة جدا مقارنة مع وفرة نيوروببتيد أخرى في الأطياف. وعلاوة على ذلك، وهذه الببتيدات هي القطبية بدلا مما يجعلها ماء نسبيا وصعبة للاحتفاظ مع استخراج الببتيد المشتركة وتقنيات الفصل .. تطبق بالتالي فإننا بروتوكول ذكرت سابقا لاستخلاص الأنسجة والمواد الأفيونية prefractionation الببتيد في تركيبة مع LC-MS/MS قياسية استنادا الببتيد تحديد 9،19. جمع أجزاء من هياكل الاكليلية الهدف من الفائدة (النواة المتكئة، رنا، المذنبة putamen، وحدة المعالجة المركزية). تركيب دماغ الفئران المجمدة في مشراح ناظم البرد وإزالة المواد المحيطة بها الدماغ (كوتكس، الحاجز، كاللوسوم) مع مشرط. جمع الأجزاء (30 ميكرون، ن = 50) من رنا تشريح وحدة المعالجة المركزية وذوبان جبل الجمعية الوطنية الكاميرونية وأجزاء وحدة المعالجة المركزية من الأقسام على مختلف الشرائح الزجاجية. استخراج الببتيدات من الأنسجة وذلك بإضافة 100 TFA 5٪ ميكرولتر ACN/0.1٪، احتضان لمدة دقيقتين، وجمع في أنابيب إيبندورف بروتين منخفض ملزم. كرر هذه الخطوة مرتين. أداء prefractionation الببتيد بواسطة قوي الموجبة تبادل اللوني باستخدام متدرج (ن = 4) شطف في القوة الأيونية زيادة 19. تجف أسفل العينات تحت فراغ باستخدام مكثف speedvac. تحليل الكسور الببتيد بواسطة C18 nanoflow عكس المرحلة اللوني السائل (1100، اجيلنت تكنولوجيز، في سانتا كلارا، كاليفورنيا) ربطه إلى كتلة electrospray الطيف جنبا إلى جنب (LC-MS/MS). وأجريت التجارب MS على هجين خطي iontrap / تحويل فورييه الأيوني سيكلوترون صدى (FTICR) صك (LTQ FT 7T، الحرارية العلمية، والتهام في ولاية ماساتشوستس) أطياف fulscan الببتيد (م / ض 150تم الحصول -2000) مع محلل FTICR على قرار كتلة عالية (100000) تليها تجزئة لاحق من قمم 5 الببتيد على أشده في iontrap عن طريق التصادم الناجم عن تفكك (CID) 9. يتم تنفيذ الببتيد تحديد تسلسل ما يناسبها من قاعدة البيانات، ويمكن أن تستكمل تحليل تسلسل دي نوفو. للبحث عن قاعدة بيانات، يتم توظيف محركات البحث المتاحة تجاريا (التميمة، XTandem أو المنقب بروتين) 20. وعادة ما يتم تنفيذ عمليات البحث على قواعد البيانات التي تحتوي على تسلسل نيوروببتيد المعروفة أو المتوقعة، وسلاسل من البروتينات السلائف neuropeptide 21. 6. ممثل النتائج MALDI الطيف الكتلي التصوير لقطاعات النسيج الجسم المخطط كما أعدت وفقا للبروتوكول وصفها هنا أسفرت عن الكشف عن أكثر من 1000 قمم المقابلة لنوع ما يقرب من 300 الجزيئية monoisotopic (أطياف متوسط ​​أظهرتفي الشكل. 1). وقد تحقق بيانات التصور لأبرز القمم أيون الجزيئية باستخدام برنامج التصوير فليكس وأظهر خاصية توزيع كثافة الذروة التي هي أيضا بما يتماشى مع الخصائص التشريحية (Fig.3). هناك سمة أخرى من IMS MALDI هو استنساخ لها جيدة نسبيا. في هذه التجربة، وكان معامل التباين الكلي لشدة الذروة من جميع الأنواع الجزيئية الكشف عن 30٪، ولكن العديد من القمم عرض تباين منخفضة جدا، واستنساخ عالية ضمن مجموعات العلاج (الشكل 4). وتعرض لشدة ذروة نسبي البيانات من أربع مناطق مختلفة من الفائدة، بما في ذلك الجزء من ظهراني إنسي ظهراني جانبي والمخططة على حد سواء lesioned وسليمة على التحليل الإحصائي. وكان من أجل ضبط لإجراء مقارنات متعددة في وقت واحد، يقوم التحليل الإحصائي عن طريق اختبار اللامعلمية باستخدام أداة SAM 18. تم العثور على ابرز التغييرات في الجزء ظهراني من المخطط، الدوبامين، المزالة التعصيب باركنسونية. هنا SI وقد لوحظت تغييرات gnificant في المعاملة بين الجماعات المختلفة لالببتيدات dynorphin اثنين؛ dynorphin باء وألفا neoendorphin (Fig.5). في التفاصيل، لوحظ وجود زيادة نسبية في كل من شدة ذروة dynorphin من 50-60٪ في الحيوانات الحركي عالية بالمقارنة مع الحيوانات مختل الحركة منخفضة والضوابط آفة (P <0.05، F (2، 15) = 12.8 DynB، F = 5،7 aNeo؛ الشكل 5). . الشكل 1 متوسط ​​MS يتتبع تم الحصول عليها من منطقتين ترتبط ارتباطا وثيقا من المخطط؛ المذنبة putamen (CPU) ونواة المتكئة (بريدا). المنطقتين عرض مختلف التشكيلات MS مع بعض الأنواع الجزيئية وأعرب فريد في منطقة واحدة، أو في مختلف مستويات كثافة الذروة (إدراج، م / ض 2028). ويمكن لنمط التوزيع المكاني للقمة كل تصور باستخدام البرمجيات المتخصصة التصوير (اللوحة السفلية). 2.JPG "/> الشكل 2 (أ) ويتم تركيب الدماغ على تشاك ناظم البرد باستخدام وسائل الاعلام التضمين (OTC؛ السهم).، والرعاية يؤخذ أن OTC لا يلوث المنطقة من الدماغ ليكون مقطوع منذ ايون OTC قمع سبب الببتيدات. (B، C) الشرائح الرقيقة (≈ سمك ميكرومتر 12) وذوبان محمولة على الشرائح الزجاجية MALDI متوافقة وتجفيفها لبضع ثوان لتفادي إلحاق ضرر التجميد كما رأينا في Microtears (D) جيم قد يكون من الصعب كشف للعين المجردة ، ولكن يضعف MALDI مصفوفة بلورة وطمس MALDI MS إشارة. المقطع نفسه ملطخة البنفسجي cresyl يكشف microtears والشقوق (صورة مجهرية أسفل اليمين). 3 الشكل. وتتمثل الخطوة الأولى في تقييم البيانات إلى تصور قمم عديدة ومختلفة عبر مجموعة جماعي حلل (منظمة العفو الدولية). هنا، تم تصوير أجزاء الجسم المخطط في الفترة من 9 الفئران مع MS MALDI. تصور من متوسط ​​إجمالي أناوسوف تكشف عن الحالية مجالات واضح شدة أيون مرتفعة أو منخفضة (سهام). يمكن أن تتأثر هذه المناطق بسبب الإفراط في أو تحت تأثير التطبيع وتشوه تحليل البيانات المساس النتائج. تعريف التشريحية سوء توزيع ذروة تكشف المقاطع مع ذروة منخفضة عموما إشارة إلى الضجيج، على سبيل المثال المادتين 3 و 9 قمم F من خلال I. يمكن الشكل 4. يتم تقييم MS استنساخ بين مجموعات العلاج عن طريق حساب متوسط ​​MS التتبع والخطأ المعياري لكل قيمة م / ض (إدراج، م / ض 722 و 1749). استنساخ جيدة تضمن التحليل الإحصائي صالح. وزيادة كبيرة في الشكل 5. Dynorphin باء وألفا neoendorphin شدة الذروة في OHDA-6-lesioned، باركنسونية، المخطط عالية مختل الحركة الحيوانات (HD، سهام) مقارنة مع مجموعة مراقبة المنخفض الحركي (LD)، وآفة (LC). شدة ذروة الببتيد كما أعرب عن متوسط ​​التغير أضعاف من جانب سليمة ± SEM (آفة / سليمة الجانب). * P <0.05؛ CX قشرة؛ مكعب الجسم الثفني. مقياس شريط 5 ملم.

Discussion

هناك العديد من المزايا المتمثلة في استخدام الطيف الكتلي MALDI التصوير في دراسة نيوروببتيد. ويمكن تحليل غير متحيز للبيانات MS تكشف عن أن نواة الدماغ معينة فقط، أو كما في النتائج المقدمة هنا حيث يرتبط فقط على جزء من المخطط ظهراني جانبي مع الحالة المرضية في جسم المريض معينة. عن طريق الإبقاء على المعلومات المكانية ومن ثم من الممكن لإعادة تحديد المناطق ذات الأهمية للتحليل احصائى مع حساسية أعلى، وانخفاض التقلبات مقارنة مع تحليل لأقسام الدماغ كله أو باستخدام التقليدية peptidomics دراسات على مقتطفات الببتيد. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أن ندرك MALDI IMS بسهولة يمكن الكشف لم تكن معروفة سابقا في مرحلة ما بعد التعديلات متعدية، ولكن التحليلات الهيكلية يجب أن تتبع لتحديد المواقع بدقة من الأحماض الأمينية التي يتم تعديلها.

المخاطر المشتركة في وضع الرؤية وIMS البيانات MALDI تشمل رسم خريطة كثافة الذروة القصوى لنطاق بصري خطي من BLACK (0٪) إلى لون (100٪) عن كل قسم في سلسلة التجارب (الشكل 3)، بدلا من رسم خرائط لجميع الفروع على نطاق ومطلق مشترك بنسبة 100٪ حيث هو كثافة الذروة القصوى من جميع أقسام (الشكل 5) . الأسلوب الأخير يسمح بمقارنة البيانات المجموعة وتصور من الاختلافات بين مجموعات العلاج.

يشكل عقبة رئيسية في تحليل IMS MALDI هو مهمة من الببتيدات إلى قمم كتلة محددة. على النسيج جنبا إلى جنب، قياس الطيف الكتلي الممكن في بعض الأحيان، ولكن غالبا ما يكون صعبا للغاية ^13،14. فإننا نجد أنه يمكن استخدام نهج أكثر التقليدية بما في ذلك تجزئة إعدادي قوي على الكاتيون تبادل اللوني، تليها مرحلة LC-MS/MS معكوسة إلى نيوروببتيد تسلسل بنجاح العديد من الببتيدات الأفيونية خاصة. فإنه لا يزال من غير المألوف للحصول على نوعية جيدة MS / MS الأطياف التي لا تتطابق مع اي مداخلة على قاعدة البيانات باستخدام محركات البحث الشائعة مثل تعويذة. في هذه الحالات من جديد، من جهة تسلسل هو فقط. tواي خيار. يمكن الحصول على الدليل القاطع على هوية الذروة من قبل IMS MALDI من المقاطع النسيجية من الماوس خروج المغلوب المناسبة، ولكن هذه ليست دائما متاحة أو ممكنة. وبديل ذلك هو للتحقق من صحة النتائج وفقا لطريقة مختلفة تماما، على سبيل المثال بواسطة immunoblotting الغربي أو المناعية. وهذا يمكن أن تشمل في كثير من الأحيان رفع الأجسام المضادة، وقدرا كبيرا من العمل التحقق من الأجسام المضادة الجديدة.

تم تحسين الاستراتيجية العامة المقدمة في هذا البروتوكول على نطاق واسع للتجارب neuropeptide IMS MALDI بما في ذلك عدة أقسام والظروف التجريبية. وقد تم تحسين البروتوكول وخاصة بالنسبة للالببتيدات الأفيونية، وسيكون له أثر كبير في الدراسات المستقبلية، كما يعملون في مجالات متنوعة من الأبحاث بما في ذلك الآليات الكامنة وراء الألم والاستجابة الذاتية للعقاقير الإدمان.

Materials

1.1 Sample collection and preparation

1. Isoflurane (Apoteksbolaget AB, Sweden)
2. Surgical tools; two pairs of scissors, a rongeur, spatula
3. Finely crushed dry ice
4. Aluminum foil and plastic bags for storage
5. Cryostat(Microm, Heidelberg, Germany)
6. Indium−tin oxide (ITO)-coated MALDI slides (Bruker Daltonics, Germany)
7. optimal cutting temperature medium (OCT) (Sakura Finetek Europe, Netherlands)
8. vacuum dessicator

1.2 Matrix application

1. Acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), ethanol (EtOH) of pro-analysis grade (Merck, Germany).
2. Trifluoroacetic acid (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).
3. Water was purified with a Milli-Q purification system (Millipore, Bedford, MA).
4. CHIP-1000 (Shimadzu, Japan) or Portrait 630 spotter (LabCyte, Sunnyvale, CA)

1.3 Mass spectrometry

1. Ultraflex II (Bruker Daltonics)
2. FlexImaging software (v 2.0, Bruker Daltonics)
3. Peptide or Protein Calibration Standard (Bruker Daltonics)

1.4 Data processing

1. Origin v.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA)
2. Matlab version 7.9.0.529 (MathWorks, Natick, MA)
3. pBin (http://www.vicc.org/biostatistics/software.php)

1.5 Neuropeptide identification

1. Ultrasound sonicator
2. 10 kDa molecular weight cut-off filter (Millipore, Bedford, MA)
3. SP Sephadex C 25 gel (Sigma, Germany)
4. Hypersil column (ThermoFisher)
5. Pyridine, formic acid (FA), Acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), ethanol (EtOH) of pro-analysis grade (Merck, Germany).
6. Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).
7. Agilent 1100 nanoflow LC, microWPS, C18 column (0.075x150mm)
8. Agilent 1100 Micro-fractioncollector, Prespotted anchorchip target plate (Bruker Daltonics)
9. BioTools software (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics)
10. Bio Works software (v.3.3, Thermo Fisher; www.thermoscientific.com )
11. Mascot software (v 2.2, MatrixScience; www.matrixscience.com )
12. Swepep database (www.swepep.org)