Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए कस्टम डिजाइन electrotactic कक्षों में 2 डी और 3 डी वातावरण स्थापित तरीकों का इस्तेमाल किया है, जो कोशिकाओं को ट्रैक कर सकते हैं दर्शाता है
Abstract
अंतर्जात बिजली क्षेत्र (EFS) vivo में प्राकृतिक रूप से पाए जाते हैं और ऊतक / अंग विकास और उत्थान के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका है कि केंद्रीय तंत्रिका प्रणाली 1,2 सहित, खेलते हैं. इन अंतर्जात EFS ईओण कोशिकाओं और ऊतकों के विद्युत प्रतिरोध के साथ संयुक्त परिवहन के सेलुलर विनियमन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. यह बताया गया है कि लागू एफई उपचार पशुओं और मनुष्यों 3,4 में रीढ़ की हड्डी की चोट के कार्य की मरम्मत को बढ़ावा कर सकते हैं. विशेष रूप में, एफई निर्देशित सेल प्रवास सहित तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं 7,8 (NPCs), सेल 5,6 प्रकार की एक विस्तृत विविधता में प्रदर्शन किया गया है. प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) EFS के आवेदन ज्यादातर प्रयोगशालाओं में सामान्य रूप से उपलब्ध तकनीक नहीं है. कि हम डीसी EFS के आवेदन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल सेल और ऊतक संस्कृतियों 5,11 पहले से वर्णित किया है. यहाँ हम मानक तरीकों में से एक वीडियो प्रदर्शन एक परिकलित फ़ील्ड करने के लिए 2 डी एक सेट की शक्ति पर आधारित प्रस्तुतNPCs के लिए 3 डी वातावरण, और 2d में दोनों एक सेल के विकास की स्थिति में एफई उत्तेजना, और organotypic 3 डी में रीढ़ की हड्डी का टुकड़ा करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच की. रीढ़ की हड्डी cordslice एनपीसी पूर्व vivo व्यवहार के बाद प्रत्यारोपण, अध्ययन है क्योंकि cytoarchitectonic ऊतक संगठन इन 9,10 संस्कृतियों के भीतर अच्छी तरह से संरक्षित है के लिए एक आदर्श प्राप्तकर्ता ऊतक है. इसके अतिरिक्त, इस पूर्व vivo मॉडल भी प्रक्रियाओं है कि तकनीकी रूप से संभव एकल कोशिका के स्तर पर समय चूक रिकॉर्डिंग का उपयोग vivo में कोशिकाओं को ट्रैक नहीं कर रहे हैं अनुमति देता है. यह गंभीर न केवल एक 2d वातावरण में सेल के व्यवहार का मूल्यांकन आवश्यक है, लेकिन यह भी एक 3 डी organotypic हालत जो vivo वातावरण में mimicks में है. इस प्रणाली की अनुमति देगा उच्च संकल्प ऊतक या अंग संस्कृति इन विट्रो और पूर्व vivo में एक सेल प्रवास के 3 डी ट्रैकिंग के साथ कवर गिलास आधारित व्यंजन का उपयोग और इमेजिंग छह में पर चलती से पहले एक मध्यवर्ती कदम हो सकता हैवो मानदंड.
Protocol
1. तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष सेल अलगाव
- E14-16 ठंड DMEM/F12 बेसल मध्यम और चूहों में जगह पूरे दिमाग से काटना. एक संरचनात्मक और एक 35 मिमी पेट्री डिश में खुर्दबीन हस्तांतरण दिमाग के तहत सभी मस्तिष्कावरण निकालें.
- संदंश का प्रयोग करें ठीक करने के लिए यंत्रवत् ऊतक टुकड़े में दिमाग को अलग कर देना और उन्हें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण करने के लिए, तो 800 rpm पर 3 मिनट के लिए नमूने के मलबे को हटाने अपकेंद्रित्र.
- DMEM/F12 युक्त bFGF और EGF जोड़ें और 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ महीन चुर्ण बनाना.
- एक सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पारित करने के लिए एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त है.
- बोतल में 2-5 पर थाली कोशिकाओं x 10 4 कोशिकाओं / एमएल, तो प्रदर्शन एक पूर्ण माध्यम हर 3 दिन और कोशिकाओं को हर 6 दिन बीतने के बदलने.
- कम से कम 5 मार्ग के बाद, पचाने neurospheres एकल कक्षों के लिए trypsin और EDTA का उपयोग करते हुए और poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic कक्षों (तैयार 2 के रूप में नीचे वर्णित) पर हो जाना. बढ़ती N2 - पूरक युक्त मध्यम का प्रयोग करें,bFGF और EGF हर समय NPCs के गुणों को बनाए रखने के लिए.
2. Electrotactic कक्ष की तैयारी
- तैयार के विभाजित छमाही में 22 x 22 मिमी नंबर 1 मोटाई coverslips एक हीरे की कलम का उपयोग autoclaved द्वारा कांच के 22 x 11 मिमी स्ट्रिप्स.
- Gluing द्वारा अच्छी तरह से आंतरिक आयामों 22 x 10 मिमी की एक गिलास मुक्त खड़े बनाएँ एक साथ चार खड़ी उच्च वैक्यूम सिलिकॉन तेल के साथ 22 x 11 मिमी स्ट्रिप्स खड़ी है. रात भर के लिए पूरी तरह से सूखे कुओं और कठोर अनुमति देते हैं.
- अगले दिन, दो 22 x 11 मिमी कांच स्ट्रिप्स देते हैं, एक दूसरे के समानांतर 10 मिमी के अंतराल छोड़, एक 100 मिमी संस्कृति सिलिकॉन तेल का उपयोग पकवान के आधार करने के लिए. इन स्ट्रिप्स के बीच क्षेत्र के एक 22 x प्रत्येक के अंत में 22 मिमी कवर पर्ची, तीन पक्षों पर तेल के साथ पकवान के नीचे से जुड़ी है, लेकिन नहीं है कि केंद्र को करीब रखकर सील.
- कांच अच्छी तरह से कवर पर 2.2 चरण में तैयार रखें फिसल जाता है ताकि आंतरिक दीवारों को बोने के लिए एक सीमित स्थान बनानेप्लेट के नीचे पर कोशिकाओं. पानी के सबूत सिलिकॉन तेल के साथ सभी जोड़ों. कोट पाली-D-lysine तो laminin के साथ इस क्रमिक रूप से सीमित क्षेत्र: कक्ष में 1 मिलीग्राम पाली-D-lysine जोड़ने और 5 मिनट के लिए छोड़ पाली-D-lysine प्लेट के नीचे करने के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देते हैं, कक्ष धोना बाँझ पीबीएस के साथ दो बार, तो बाँझ पीबीएस में laminin पतला 20 μg / एमएल उपज और प्लेट के नीचे कवर करने के लिए उपयोग. रात से अधिक कमरे के तापमान पर छोड़ दें.
- अगले दिन, फसल कोशिकाओं और 1 x 104 कोशिकाओं से युक्त निलंबन के 1 मिलीग्राम तैयार. अच्छी तरह से कांच से laminin निकालें, शुष्क हवा पूरी तरह से, और सेल निलंबन के 1 मिलीग्राम के साथ बदलने की अनुमति है. 37 ° C पर 4 घंटे की एक न्यूनतम लगाव के लिए अनुमति देने के लिए मशीन में पकवान प्लेस.
- एक बार कोशिकाओं को पर्याप्त मिला हुआ हैं कक्ष से सभी मध्यम हटा दें. ध्यान से कांच अच्छी तरह से हटा दें. ध्यान से संलग्न करके कक्षों के ऊपर एक छत, सिलिकॉन तेल, एक autoclaved 22 मिमी x 22 गिलास coverslip साथ फार्मदो 22 x 11 मिमी स्ट्रिप्स के बीच ब्रिजिंग. मध्यम की कुछ बूंदों के साथ कोशिकाओं को कवर करने के लिए बाहर सुखाने से बचने के लिए.
- कक्ष के प्रत्येक के अंत में दो निर्विवाद सिलिकॉन तेल कक्ष छत पर पकवान के एक किनारे से दूसरे को चलाने के लिए बाधाओं, बनाने के द्वारा एक पृथक मध्यम जलाशय के रूप में. ताजा माध्यम के साथ कक्ष, एक मध्यम जलाशय से एक दूसरे के माध्यम से प्रवाह को सुनिश्चित करने भरें. इनक्यूबेटर में 12 सेल वसूली के लिए अनुमति देने के लिए घंटे के लिए पकवान लौटें.
3. एक बिजली के क्षेत्र electrotactic चैम्बर के लिए आवेदन
- दो छेद, एक प्रवास कक्ष की प्रत्येक जलाशय पर तैनात ड्रिलिंग द्वारा पकवान कवर एक ढक्कन तैयार.
- बदलें संस्कृति 25 मिमी HEPES के बफर युक्त मध्यम के साथ कक्ष में सभी मध्यम और तापमान नियंत्रित इमेजिंग प्रणाली को पकवान हस्तांतरण. समय चूक और बहु स्थिति रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोगात्मक मानकों सेट. इतना है कि कैथोड और anode कक्ष संरेखितपर छोड़ दिया और सही क्रमशः, करने के लिए सुनिश्चित करें कि एफई वेक्टर चलाता है क्षैतिज रूप में नीचे खुर्दबीन देखी और इमेजिंग सिस्टम में दर्ज की गई.
- स्टाइनबर्ग के समाधान (58 मिमी NaCl, 0.67 मिमी KCl, 0.44 मिमी Ca (3 सं) 2 0.4 2 0, 1.3 मिमी MgSO 4 0.7 एच 2 0 एच और 4.6 मिमी Trizma, आधार, 7.4 पीएच) के साथ दो beakers भरें. प्रत्येक मध्यम जलाशय के लिए एक अलग बीकर पूर्व तैयार ग्लास (कांच ~ 13 सेमी लंबी और ~ 3 मिमी व्यास, और एक लेम्प लौ में हीटिंग के द्वारा एक U-आकार में तुला ट्यूब) पुल, 2% (डब्ल्यू / के साथ भर का उपयोग कर कनेक्ट v) समाधान Steinberg's - अगर, ढक्कन में छेद के माध्यम से गुजर रहा है. / एजी AgCl है स्टाइनबर्ग समाधान के प्रत्येक बीकर में एक डीसी बिजली की आपूर्ति से जुड़े इलेक्ट्रोड रखकर बिजली के सर्किट को पूरा.
- 0 पर स्विच बिजली की आपूर्ति पर वोल्टेज डायल सेट. Electrotactic कक्ष भर में वोल्टेज उपाय जबकि वोल्टेज डायल मोड़, एक वोल्टेज मीटर का उपयोग कर, और प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप समायोजित.
- समय चूक रिकॉर्डिंग शुरू. एक मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन और वोल्टेज बदल डालना, के रूप में आवश्यक है, हर घंटे. ताजा मध्यम, दवाओं, या रासायनिक एजेंटों जलाशयों करने के लिए जोड़ा जा सकता है के रूप में आवश्यक है. जब मध्यम परिवर्तन करने के लिए, दो विकल्प नीचे के रूप में माना जा सकता है:
- विकल्प नंबर 1 - रिकॉर्डिंग समय चूक अस्थायी रूप से रोकने के लिए, ध्यान कक्ष से कांच के पुलों को दूर करने के लिए कवर ढक्कन perturbing से बचने के लिए, एक निष्फल पाश्चर विंदुक धीरे उपयोग ताजा माध्यम के साथ सभी की जगह मध्यम और कांच पुलों वापस डाल, तो फिर से शुरू रिकॉर्डिंग.
- विकल्प संख्या 2 - वैकल्पिक रूप से, कस्टम 4 छेद (दो प्रवास कक्ष में से प्रत्येक जलाशय के ऊपर स्थित) के साथ कवर ढक्कन मध्यम परिवर्तन प्रयोजन के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है. एक कांच पुलों कनेक्शन के लिए दो मध्यम बदलने के लिए अन्य दो. विकल्प 2 मध्यम परिवर्तन के दौरान हस्तक्षेप के बिना सतत रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है.
4. Organotypic रीढ़ की हड्डी टुकड़ा की तैयारी
- Lumb काटना2 सप्ताह पुराने C57 बीएल / 6 चूहों की गिरफ्तारी रीढ़ की हड्डी डोरियों.
- 500 माइक्रोन मोटी वर्गों में एक McIlwain ऊतक हेलिकॉप्टर के साथ रीढ़ की हड्डी डोरियों टुकड़ा.
- एक संरचनात्मक खुर्दबीन के नीचे अलग स्लाइस और बाण के समान बरकरार / अक्षीय रीढ़ की हड्डी संरचना के साथ स्लाइस का चयन करें.
- प्लेट स्लाइस में एक 35 मिमी पेट्री 30 μl Matrigel और उन्हें जगह युक्त पकवान के रूप में संभव के रूप में केंद्र के करीब है और उन्हें कम से कम 30 मिनट के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ° C पर बनाए रखने तक Matrigel प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए स्वयं को इकट्ठा एक पतली फिल्म है कि रीढ़ की हड्डी टुकड़ा की सतह को शामिल किया गया है. यह बहुत महत्वपूर्ण है करने के लिए सुनिश्चित करें कि Matrigel इकट्ठा किया गया है पूरी तरह से एक और यदि आवश्यक हो तो 30 मिनट के लिए, 37 ° C पर पेट्री डिश सेते हैं.
- 4-6 मिलीग्राम DMEM/F-12 25 मिमी HEPES बफर और 15-20% भ्रूण बछड़ा सीरम बहुत धीरे से इतनी के रूप में शामिल टुकड़ा पर मध्यम प्रवाह से बचने के सीधे मध्यम जोड़ें. सुनिश्चित करें कि टुकड़ा पूरी तरह से मध्यम में नहीं डूबे हुए है, अच्छी तरह से अवगत कराया explants की सतह छोड़नेहवा. दो बार साप्ताहिक मध्यम बदलें.
5. Hoechst +३३,३४२ लेबल NPCs के organotypic रीढ़ की हड्डी टुकड़ा में इंजेक्शन
- 1 पर एनपीसी निलंबन × 10 6 कोशिकाओं / μl तैयार.
- मध्यम में 30 मिनट के लिए 5 Hoechst 33,342 माइक्रोन के साथ सेल निलंबन पूर्व सेते हैं.
- रीढ़ की हड्डी टुकड़ा में एक खुर्दबीन के नीचे निलंबन की 2 μl धीरे microinject केशिका ग्लास ट्यूब का प्रयोग करें. सुनिश्चित करें कि केशिका ग्लास ट्यूब Matrigel (खुर्दबीन के नीचे गुलाबी भाग) के माध्यम से गुजरता है और रीढ़ की हड्डी टुकड़ा (खुर्दबीन के नीचे ग्रे ऊतक) के अंदर तक पहुँचने के लिए, कम से कम 30 सेकंड के लिए रीढ़ की हड्डी टुकड़ा अंदर रहने के लिए सेल पर चलाने के निलंबन से बचने के. पेट्री डिश इनक्यूबेटर में रीढ़ की हड्डी टुकड़ा युक्त (37 2 ° सी 5% सीओ) रखो और यह रात में छोड़ दें.
- अगले दिन, रीढ़ की हड्डी में 33,342 - लेबल NPCs electrotactic कक्ष में Hoechst युक्त टुकड़ा 500 mV / मिमी की एक EF (में वर्णित तरीकों का उपयोग कर लागू) 3.
6. प्रतिनिधि परिणाम
जब NPCs शारीरिक EFS वे अत्यधिक कैथोड की ओर निर्देशित सेल प्रवास (चित्रा 1) से पता चला है की एक सीमा से अवगत कराया गया. वही अवलोकन भी के organotypic रीढ़ की हड्डी टुकड़ा पूर्व vivo मॉडल, vivo परिस्थितियों में एक 3 डी वातावरण नकल उतार (चित्रा 2) पर एक एकल कोशिका के स्तर पर किया गया था.
आकृति 1. NPCs EFS में निर्देशित प्रवास. पीसी कैथोड की ओर अत्यधिक निर्देशित प्रवास से पता चला है जब EFS करने के लिए संपर्क, लाल लाइनों और नीले तीर trajectories और सेल आंदोलन की दिशा (ए) का प्रतिनिधित्व करते हैं. बी NPCs के प्रवास पथ दिखाता है. बार: 50 माइक्रोन.
चित्रा 2. प्रतिरोपित NPCs organotypic रीढ़ की हड्डी टुकड़ा में कैथोड की ओर निर्देशित प्रवास दिखा
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Discussion
प्रोटोकॉल का उपयोग हम पिछले 5,11 अध्ययन पर आधारित हैं. इन विधियों का प्रयोग, स्थिर संस्कृति और बिजली की मौजूदा परिस्थितियों जबकि एक EF अगर पुलों, स्टाइनबर्ग समाधान, और कस्टम डिजाइन मानकीकृत और सटीक आयाम electrotactic कक्षों में संवर्धित कोशिकाओं या स्लाइस के लिए / एजी AgCl है इलेक्ट्रोड, के माध्यम से लागू करने को बनाए रखा जा सकता है. कक्षों की गहराई के लिए अलग नमूना 11 मोटाई को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, और कोशिकाओं के मामले में, कक्ष आकार को समायोजित संशोधित किया जा सकता है लेकिन कई कोशिकाओं की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण कई कोशिकाओं की आवश्यकता है). हम संशोधित और इन तरीकों विकसित करने के लिए प्रक्रियाओं है कि तकनीकी रूप से एक एकल कोशिका के स्तर पर समय चूक रिकॉर्डिंग का उपयोग vivo में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए संभव नहीं कर रहे हैं की अनुमति है. EFS के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर पिछले अनुसंधान के बहुमत, 2D वातावरण में आयोजित किया गया है. एक एकल कोशिका के स्तर पर NPCs की electrotactic प्रतिक्रिया के vivo अध्ययन मेंनिर्णायक प्रमाण उपलब्ध कराने के लिए किसी भी शारीरिक प्रासंगिकता सिद्ध होगा. बहरहाल, यह तकनीकी रूप से बहुत मुश्किल है मौजूदा प्रौद्योगिकी के साथ प्राप्त करने के लिए, खासकर जब वास्तविक समय सेल प्रवास रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की कोशिश कर. हम आगे कदम उठाए हैं एक पूर्व vivo में organotypic रीढ़ की हड्डी टुकड़ा संस्कृति मॉडल स्थापित करने के लिए, निकट vivo वातावरण में नकल उतार, प्रदर्शन है कि कोशिकाओं को अभी भी एक 3 डी वातावरण में एक electrotactic प्रतिक्रिया के अधिकारी के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है. इस विधि भी EFS के सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता पर प्रभाव एक organotypic 3 डी वातावरण के भीतर उपकला ऊतक में घाव भरने, महाधमनी अंगूठी या लड़की सीएएम में angiogenesis के रूप में देखने के लिए उपयुक्त हो सकता है और लड़की भ्रूण में संभवतः आनुवंशिक प्रभाव .
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के रॉयल सोसाइटी URF UF051616 अनुदान, ब्रिटेन और यूरोपीय अनुसंधान परिषद STG बी एस 243,261 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. MZ प्रयोगशाला में काम भी पुनर्योजी चिकित्सा RB1 01,417 अनुदान के कैलिफोर्निया संस्थान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | EMD Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
References
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