裂殖酵母,<em>裂殖酵母</em>,是一个很好的模型系统研究的基本细胞过程。在这里,我们描述了一种方法来执行裂殖酵母活细胞定量分析。在这个特殊的实验中,我们专注于细胞核内的基因组的组织,但该方法也可用于研究细胞质的因素。
一些显微技术,可以检测出一个特定的蛋白质在细胞内的今天。在过去的十年使用直接连接到蛋白的绿色荧光蛋白(GFP)的荧光活细胞成像已成为越来越受欢迎。使用GFP和类似荧光蛋白质的亚细胞本地化和运动可以在荧光显微镜检测。此外,亚核本地化的染色体中的某些区域也可以使用这种技术的研究。 GFP是融合到lac阻遏蛋白(LacR)和异位的法律咨询及田土转易处序列串联重复序列已被插入到2号染色体上的兴趣区域的细胞中表达。 LacR – GFP将绑定到的法律咨询及田土转易处重复和该区域的基因组将作为一个绿点在荧光显微镜可见。酵母是特别适合这种类型的操纵,因为同源重组是非常有效的,从而可以有针对性的统一的法律咨询及田土转易处重复和工程融合蛋白与GFP 3。在这里,我们描述了裂殖酵母活细胞分析的定量方法。裂殖酵母活细胞分析的附加 议定书“,可以发现,例如,如何使电影减数分裂染色体行为4。在这个特殊的实验中,我们将集中在亚核组织,以及它是如何在基因诱导的影响。我们引进法律咨询及田土转易处结合位点的基因附近的一个基因簇,Chr1命名,标记。丰富,早在裂殖酵母5氮饥饿诱导基因的基因簇。应变核膜(nm)为标记由mCherry附件NM蛋白Cut11上升到一个红色荧光信号。 Sid4纺锤体极体(SPB)化合物是融合红色荧光蛋白(Sid4 MRFP)6 </s>。在酵母细胞无性增长中的着丝粒是一贯重视的国家邮政局,是嵌入在NM 7 。被认定为国家邮政局在新墨西哥州的一家大型圆形结构。由成像前20分钟,氮源耗尽后,我们可以判断基因簇(GFP)和网管/国家邮政局之间的距离。氮耗尽之前和之后的均值或中位数的距离相比,因此,我们可以量化是否有一个氮枯竭后的基因簇的亚细胞定位的转变。
在过去十年中的活细胞成像的使用,监测细胞活动已成为越来越受欢迎。它开始从维多利亚水母水母的绿色荧光蛋白的使用,现在都可以通过许多不同的荧光发光的荧光从青色的宽光谱(475纳米)远红光(648 nm)的11。对免疫活细胞成像的主要优点之一是细胞是不固定的甲醛或乙醇/丙酮处理之前显微镜,从而避免可能的固定过程的文物。此外,活细胞成像,提供了可能,按照单个细胞,并采取频繁的照片在小时或天的潜伏期,从而有可能获得12个细胞的活动电影。哺乳动物细胞的尺寸较大的优势,直径大约100微米,直径约3-4相比较小的酵母细胞mu的M.的另一方面,与酵母的优点是很容易被操纵的基因组。同源重组发生在酵母和非常有效地用于保险丝利益的3个不同的荧光蛋白质。此外,使用有针对性的法律咨询及田土转易处的序列和随后LacR – GFP蛋白表达的一体化,使细胞核内的基因组中的一个特定部分的检测。使用S。裂殖酵母细胞在显微镜具有额外的优势,因为它们是自然生长快一代人的时间在低成本的细胞培养条件的单细胞生物。此外,S.酵母是一个很好的,因为它有后生动物同源基因的真核模式生物。
这项技术的主要限制之一是令人不安的真实信号的检测在酵母细胞自体荧光。这个问题是可以克服的,由最小的生长介质,而不是使用过滤消毒葡萄糖蒸压。在此外,酵母细胞应安装前增长数期为2天。这里介绍的协议提供了一个相对简单,但尚未定量的方法来确定的酵母细胞内蛋白质的亚细胞定位。此外,在不同时间点拍照,我们可以按照细胞的活动。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢我们株教授平冈。我们承认从戈兰Gustafssons基金会和瑞典癌症协会(九百三十九分之二千零八)的支持。
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comment |
Lectin | Sigma | L1395 | |
Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Zeiss | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |