Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

Summary

Este protocolo descreve a derivação de gliais Precursores restritos a partir de medulas espinais fetais e mantido in vitro, quer para transplantação ou para o estudo da linhagem oligodendrocytic.

Abstract

Este é um protocolo para a derivação de gliais restritas precursor (GRP), as células da medula espinal de fetos de rato E13. Estas células são precursores precoces dentro da linhagem de células oligodendrocytic. Recentemente, estas células têm sido estudadas como fonte potencial para terapias de reparação em doenças da substância branca. Leucomalácia periventricular (LPV) é a principal causa de não-genéticos doença da substância branca na infância e afeta até 50% dos prematuros extremos. Os dados sugerem uma maior suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento de hipóxia-isquemia, estresse oxidativo e excitotoxicidade, que visa seletivamente substância branca nascente. Gliais precursores restritos (GRP), células progenitoras de oligodendrócitos (OPC) e oligodendrócitos imaturos (preOL) parecem ser os principais intervenientes no desenvolvimento de LPV e são objecto de prosseguimento de estudos. Além disso, estudos anteriores identificaram um subconjunto de tecido do SNC que tem aumentado a susceptibilidade a excitotoxicidade do glutamato comobem como um padrão de desenvolvimento para a suscetibilidade. O nosso laboratório está actualmente a investigar o papel das células progenitoras de oligodendrócitos em células PVL e utilização na fase de desenvolvimento de GRP. Nós utilizamos essas células derivadas de PRFV em vários paradigmas experimentais para testar sua resposta para selecionar tensões consistentes com LPV. GRP células podem ser manipuladas in vitro em OPCs e preOL para experimentos com modelos animais de transplante PVL e modelos in vitro de PVL-como insultos, incluindo hipóxia-isquemia. Ao utilizar células cultivadas in vitro e estudos não seria reduzida variabilidade entre os experimentos o que facilita a interpretação dos dados. Células de cultura também permite o enriquecimento da população GRP enquanto minimiza o impacto de contaminar as células de não-GRP fenótipo.

Protocol

Introdução Neste protocolo vamos mostrar como extrair, selecionar e placa gliais restritas precursor (GRP), as células da medula espinhal de fetos de rato E13. Estas células são precursores precoces dentro dos linhagens celulares oligodendrocytic e astrocitária e são definidos pela sua expressão de A2B5. No meio de GRP suplementado com FGF-2, os A2B5 GRPs + de começará expressando o início dos anos oligodendrocytic linhagem marcadores PDGFαR e NG2 1,2. Estas células da linhagem de oligodendrócitos passar através de uma série de fases distintas fenotípicas, cada um deles caracterizada por alterações morfológicas, bem como a expressão de marcadores específicos para estádios de desenvolvimento. Essas células precursoras estão actualmente a ser estudada como uma fonte potencial de células-abordagens terapêuticas baseadas nos distúrbios da matéria branca do sistema nervoso central, incluindo esclerose múltipla, leucodistrofias e leucomalácia periventricular (LPV) 3,4,5,6 </sup>. Estudos utilizando cérebro humano derivado de precursores de linhagem de oligodendrócitos relataram remielinização bem sucedido em cérebros de o modelo dysmyelination shiverer rato bem como na desmielinização modelos de roedores da medula espinal 6,7,8,9. Estas células precursoras da glia também têm sido utilizados em estudos de outros modelos de substância branca de doença tais como lesão da medula espinal e esclerose lateral amiotrófica 10,11,12,13. Nosso laboratório desenvolveu um modelo de rato pós-natal precoce hipóxia-isquemia com a qual estamos avaliando a eficácia destes medula espinhal derivadas de células GRP como uma abordagem restaurativa no PVL, a principal causa de paralisia cerebral 14,15,16. Existe também um cérebro de roedores derivado modelo OPC que tem sido amplamente utilizada para estudar a lesão da substância branca uma vez que as células de GRP tem uma tendência para se diferenciarem em a via astrocítica 17. O fenótipo OPC já entrou no caminho linhagem de oligodendrócitos, um fenômeno que parece irreversible. No entanto, estamos interessados ​​em avaliar a resposta de um espectro mais amplo de progenitores oligodendrócitos incluindo GRPs e, possivelmente, até mesmo os NEPS derivados em E10.5. Por este motivo adotamos o modelo derivado da medula espinhal GRP para o nosso trabalho. Além da utilização de GRPs para substituição de células, a derivação destas células de tipo selvagem e modelos de roedores transgénicos de doenças da substância branca permite um estudo mais aprofundado diferenciação glial em condições normais e de doença em um em configuração vitro. Publicações anteriores mostram evidências de vulnerabilidade seletiva de células precursoras da linhagem oligodendrocytic a vários estressores externos, como a maturação excitotoxicidade do glutamato dependente, estresse oxidativo, e os fatores envolvidos na escolha neuroinflamação 18,19. Nossos estudos têm-se centrado na compreensão dos mecanismos celulares e moleculares por trás do desenvolvimento dessas lesões da substância branca, avaliando a suscetibilidade das células emo espectro linhagem de oligodendrócitos para insultar, bem como analisar supostas abordagens terapêuticas. Materiais Todos os procedimentos que envolvem animais em conformidade com a política eo PHS IACUC JHU. Todos os procedimentos devem ser realizados em uma câmara de fluxo laminar a fim de manter condições assépticas. Comumente dissecações são realizadas de uma câmara de fluxo horizontal e in vitro trabalho numa câmara de fluxo vertical. Todos os meios utilizados frio durante dissecações. Os ratos utilizados em nosso estudo são um tipo selvagem CD-1 e uma cepa transgênica GFP em um fundo C57/BL6. Um CD-1 represa mouse normalmente produz 10 fetos + que são suficientes para sementes 1-2 T25 frascos. Normalmente, duas barragens são sacrificados em um tempo e fetais medulas espinhais agrupados e semeadas em 1 frasco T25 por barragem. Uma vez que as células foram derivados podem ser expandidos e caracterizadas in vitro para estudos posteriores. 1. Preparação de Mídia e garrafas GRP estoquemeio é utilizado como o meio de dissecção: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) N2 (100X; Invitrogen) Suplementos e albumina de soro bovino (BSA; 0,5% w / v). A dissociação média: mesmo como meio de dissecção. O meio de cultura: meio GRP estoque + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) e heparina (1 ug / ml; Sigma). PLL / laminina revestidos 75 cm 2 ou 25 cm 2 frascos T75 (ou T25). Frascos de cultura de tecidos (75 cm 2, Falcon) foram revestidas com 15-20μg/ml poli-L-lisina (PLL; Sigma) em H2O destilada, incubados a 37 ° C durante 1 hora, em seguida, aspirado. Frascos são lavadas com PBS 1X, em seguida, revestidas com ug 15-20 / laminina ml (Sigma) em PBS a 37 ° C durante 1 h, então aspirado e PBS fresco ou meios adicionado até que as células estão prontas para ser revestido. Após revestimento, frascos nunca deve ser deixada a secar, mas pode ser mantido em PBS ou meio a 4 ° C durante breves períodos antes da utilização. 2. Instrumentos e M Outrosaterial Placas de Petri: 4 barragens por: 3 placas de Petri para dissecção (75 mm), um prato de 20 mm para recolher os cabos colhidos da coluna vertebral. Tesoura maior (43 mm tesoura operacionais, Roboz) e uma pinça para a abertura do abdome da barragem s. Tesoura pequena para dissecar o útero e remover os fetos (15 mm Micro tesoura de dissecção, Roboz). Micro tesoura mola Dissecando (6 mm) para dissecar a medula espinhal do feto. Dissecando Micro Pinça angulada para ancorar o corpo da barragem e fetal durante a cirurgia e depois a remoção da medula espinhal, uma vez exposta. 40 ou 70 células filtro micrômetro para a remoção de detritos de células antes da semeadura. 0,05% de tripsina pré-aquecida a 37 ° C. 10 mg / ml de ADNase 1 (Sigma), preparado como um stock 100x (1 g / ml). Bio perigo-saco para cadáveres de animais. 15 e 50 tubos de centrífuga ml para o processamento extraída medulas espinais. 3. Determinar Timed Pregnancy Barragens rato grávidas ou são ordenadas a partir de fontes comerciais, especificando a entrega no dia embrionário E12 ou E13 do desenvolvimento fetal ou gravidez determinado in-house. Em suma, duas fêmeas são colocadas junto com um macho no final da tarde e saiu durante a noite juntos. No dia seguinte, as fêmeas são observadas para a presença do tampão de muco vaginal localizado. O tampão de muco é apenas uma indicação de que o acasalamento ocorreu tão animais são subsequentemente pesados ​​diariamente para monitorar taxa de aumento de peso. O dia em que o tampão de muco é observada é definido como um dia embrionário (E1). 4. Derivação tecido Trabalhar sob uma capela de fluxo horizontal para manter as condições assépticas. Pulverizar para baixo do capô e área de trabalho com etanol 70%. Instrumentos autoclave ou pulverização liberalmente com etanol 70%. Prepare instrumentos, mídia e microscópio para uso. Despeje 20 ml de meio de dissecção fria em estéril Petri dish. Anestesiar animal com hidrato de cloral (500 mg / kg) administrado intraperitonealmente (IP), seguido por deslocamento cervical ou decapitação. Pulverizar a área abdominal da mãe com etanol 70-90% (desinfecção) Abra abdômen com tesoura grande e fórceps. No CD1 e C57/BL6 cepas: Geralmente de 8 a 14 fetos estarão dentro do útero. O número de fetos é a estirpe dependente. Extraia o útero do rato, incluindo os filhotes e coloque em meio dissecção fria e fresca em uma placa de Petri limpa para lavar o sangue e restos de tecido do feto. Extraia cada feto do corno uterino e separá-los do saco embrionário e placenta usando as pequenas tesouras. Transfira os fetos extraídos em meio de dissecção fresco numa nova placa de Petri. Meio de dissecção deve ser a uma temperatura baixa para reduzir a actividade metabólica e preservar a viabilidade das células derivadas. Trabalhe a partir de agora com duas pinças emicro dissecação mola-tesoura. Trabalhando sob microscópio de dissecção, corte a pele ao longo da medula espinhal com a tesoura micro cirúrgicos e pele casca de volta para expor a medula espinhal. Transecão da medula espinal com a tesoura microcirúrgicos menos cerca de C1 e no início da cauda. Retire a medula espinhal com uma pinça sem corte, garantir que todos os ossos e cartilagens são removidos e transferir a 3 ª placa de Petri de dissecar médio. Para evitar o crescimento excessivo do tecido meníngea em culturas de células subsequentes tentar remover o máximo das meninges possível da medula espinhal. Devido às nascentes salientes nervos periféricos isto é mais difícil do que a remoção de tecido de cérebro meníngea extraído. Uma vez meninges foram removidos, transfira medulas espinhais de 20 milímetros prato Petri Limpar cuidadosamente por pulverização a área com etanol 70-90%. Os passos seguintes para a dissociação deve ser feito rapidamente para manteruma alta viabilidade do tecido da medula espinal derivada. 5. Estabelecimento Cultura Tripsina deve ser pré-aquecido durante pelo menos 30 min, em um 37 ° CH 2 O banho-maria. Uma alíquota apropriado deve ser removido a partir do stock para reduzir a exposição do material a flutuações de temperatura. Transferir colhidos os cordões da coluna vertebral para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 10 ml de pré-aquecida de tripsina (0,05%; Qualidade Biologicals) e 100 uL de DNAse (10 mg / ml) e tritura-se brevemente. Incubar em 37 ° CH 2 O banho-maria durante 10 minutos. Tritura-se e incubar durante mais 10 min. Adicionar 5 ml de GRP médio (definido acima) e centrifugação durante 5 min a 1000 RPM. Aspirar o sobrenadante e ressuspender pelete com 10 médio GRP ml e adicionar DNAse-1 (10 mg / ml; Sigma). Incubar em 37 ° CH 2 O banho-maria durante 10 minutos. Centrifugar 5 min a 1000 RPM e aspirar o sobrenadante. Ressuspender o pellet com fresh médio GRP detritos, em seguida, com um filtro de 40-70 coador de células mM. Placa no PLL / laminina 25 cm revestido 2 frascos (T25) e incubar a 37 ° C, humidade de 95% e 5% de CO 2. 100 mídias% em mudar do dia seguinte. Neste ponto, GRPs ter ligado e começou a estender processos. 6. Immunopanning da População GRP Placa de tecido da medula espinhal em PLL / laminina frascos revestidos até balão é de 85-90% confluentes ou cerca de uma semana. Células de colheita por raspagem balão com um polícia de borracha ou com tripsina a 0,05%, tritura-se cuidadosamente, mas com cuidado, centrifugar a 1000 rpm durante 5 min e completamente pelete ressuspender com 3 ml médio GRP. Transferir 1 ml de cada para 3 T25 frascos ou 3 ml de uma T75 balão adicionar volumes adequados de meio para cobrir completamente as células e permitir frascos para atingir confluência de 80-90%. Alterar mídia todos os dias, mais cedo se esgota rapidamente médio. Brasão bacteriológica Pepratos tri (75 mm) durante a noite a 4 ° C com um anticorpo IgM anti-rato (Southern Biotech), 10 ug / ml em PBS. Aspirar o tampão em excesso e lavar os pratos de Petri 3x com PBS. Adicionar A2B5 anticorpo (Millipore), a uma concentração de 5 ug / ml diluído em PBS e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente (RT). Lavar as placas de novo 3x com PBS, em seguida, adicionar 8 ml de meio de GRP para evitar a secagem da placa. Transferir 5 ml de meio de GRP a partir de placas de Petri e células GRP colheita por raspagem frascos com um polícia de borracha para separar todas as células Triturar suspensão de células rapidamente para quebrar pedaços e transferir suspensão de células 5ml aos A2B5 revestidos pratos de Petri bacteriológicos. Incubar 1 hora à temperatura ambiente sem agitação. Após 1 h de mídia aspirado e as placas de lavagem 8x com PBS. Raspe as células com um policial de borracha em 2 ml GRP mídia, em seguida, transferir para PLL / laminina placas revestidas ou frascos com volume adequado de meio GRP. </li> 7. Congelamento e armazenamento de células derivadas As células são colhidas a partir de um 85-90% T25 ou T75 balão confluente com 2 ml de tripsina a 0,05%. Tripsina é diluído e inactivada com 8ml médio estoque GRP e centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min. Pelotas de T25 frascos são ressuspensas em 1 ml de GRP meio de congelação, (GRP médio estoque suplementado com 10% (v / v) de DMSO e, opcionalmente, de FBS 20%). Os peletes maiores a partir de frascos T75 são diluídas duas vezes. As suspensões de células de 1,5 – 3 x 10 10,11,12,13 células são transferidas para frascos criogénicas (Nalgene) e armazenados durante a noite num recipiente criogénico (Nalgene) contendo isopropanol a -80 ° C a congelar lentamente durante a noite. Na sequência durante a noite células de congelamento são transferidos para caixas de congeladores e armazenado 6 meses a 1 ano à temperatura de -80 ° C ou a longo prazo em N (l). As células descongeladas são tipicamente de 60-80% viável dependendo em grande parte a qualidade do revestimento PLL / laminina. </ol> 8. Os resultados representativos CO 2 não é usado para anestesiar o animal por causa do efeito possível a jusante na viabilidade dos fetos e, finalmente, as células derivadas. Além disso, será muito difícil de remover totalmente as meninges da medula espinhal durante o procedimento de derivação, mas a combinação de GRP médio e immunopanning irá eliminar estas células de crescimento rápido. Do mesmo modo, toda a medula espinhal é colhida, apesar de uma maior concentração ventral da população GRP, devido à sua origem na medula espinal ventral e migrar dorsalmente 20. No entanto, o meio de GRP selecciona para o fenótipo GRP e de que a população é maximizada por A2B5 immunopanning. Após o plaqueamento tecidos medulares, as culturas in vitro são incubadas durante duas passagens ou cerca de uma semana. Após 2 dias em cultura, as células de diferentes morfologias pode ser observado nos frascos de cultura de tecidos que indicam o heteroátomogeneidade da população, mas o meio de GRP selecciona para o fenótipo GRP. Essas células são uma combinação de A2B5 + de GRP, E-NCAM + de precursores neuronais restritas (PNR) e nestina + e A2B5-neuroepiteliais células e possivelmente fibronectina + meníngeos células. Além disso, fenótipos mais maduras podem estar presentes marcadores que expressam incluindo doublecortin e TUJ1 para a linhagem neuronal, GFAP para astrócitos e PDGFaR e GalC para a linhagem oligo A fim de maximizar uma altamente GRP população enriquecida a partir da piscina de partida heterogénea (Figura 1A), as células podem ser duas vezes immunopanned para seleccionar e eliminar os E-NCAM + de células seguida por selecção para o A2B5 + população GRP uma vez densidade celular aumentou para cerca de 85-90% de confluência em frascos T75. Estas células GRP manter a sua capacidade de se tornar astrócitos apesar de estar em um meio que selecciona para o fenótipo A2B5 oligodendrócito assim immunopanning subsequente pode ser necessária para manter uma população altamente enriquecida GRP. Immunopanning Generrendimento aliado até 95% A2B5 + de células, mas para o rendimento de ainda maior A2B5 conjugados esferas magnéticas (Miltenyi Biotec, Inc.) pode ser usado para fornecer um rendimento de até 97%. Vigilância nas culturas de manutenção GRP, tais como mudanças regulares meios irá minimizar a proliferação de tipos de células não-GRP. Mesmo na ausência de BMP-4 astrócitos pode ainda ser encontrado e empobrecido meios de comunicação em particular, parece induzir a diferenciação para um fenótipo astrocítica. Embora o suplemento B27 contém tri-iodotironina hormonal (T3), não houve nenhuma tendência observada para se diferenciarem em oligodendrócitos na população GRP, apenas quando os níveis mais elevados de T3 são adicionados ao meio de não ocorrer este fenómeno. No entanto, um T3 B27 suplemento livre pode ser substituído se existe uma preocupação para a contaminação por oligodendrócitos maduros (Figura 1B). Estas células GRP podem ser prontamente identificados pela sua morfologia de soma pequena com 2 ou 3 processos curtos, mas para o rastreio de outros tipos de células que podem estar presentes, immunocytochemistry pode ser realizada para as anteriormente denominadas marcadores comuns do tipo de desenvolvimento e de células específicos. Há será normalmente uma pequena população persistente de A2B5 de células que são neuroepitelial (NEP) e capaz de se tornar, quer GRP ou NRP. Felizmente, as células mais longos são mantidas no meio de GRP o mais provável que o meio irá seleccionar para o fenótipo GRP. Figura 1. A) Plated células da medula espinal de morfologia heterogénea são observados após 2 dias em cultura. B) Immunopanning maximiza uma população altamente GRP enriquecido a partir da piscina de partida heterogénea.

Discussion

<p class="jove_content"Transtornos de matéria branca do sistema nervoso central incluem um grande número de etiologias, incluindo genéticas, causas inflamatórias, isquémica e tóxico^{19,21,22,23,24}. Enquanto a esclerose múltipla e vasculopatias são a principal causa de doença matéria branca em adultos, leucoencefalomalácia associada com a prematuridade é a causa mais comum de lesão matéria branca na população infantil. A fim de delinear mecanismos da doença um estudo mais aprofundado de células da linhagem ofoligodendrocytic, que são bastante afetados pelo insulto perinatal, é necessária. GRPs foram isolados a partir do roedor medula espinal embrionária e mostrou ser tripotential na natureza, dando origem a oligodendrócitos e astrócitos duas populações distintas, mas não se diferenciar em neurónios^2,25,26. Da mesma forma, as células precursoras de oligodendrócitos (OPC) derivadas de rato nervo óptico e cérebro do rato tarde embrionário ou pós-natal têm sido demonstradas para amadurecer em oligodendrócitos em funcionamento nas condições de suportes adequados^27,28. Além disso, fetal ou adultos derivado OPC humana foram ainda manipulado para mais maduros fenótipos oligodendrócitos^29,30.</p><p class="jove_content"Células> GRP têm sido isolados a partir de ambos a medula espinhal de E13.5 ratos e E12-13,5 em ratinhos. Nas diferenças de ratos têm sido relatados entre as células GRP-dorsal e ventral derivado em sua resposta às condições que promovam a geração de oligodendrócitos, astrócitos ou ventral com derivados de GRPs exibindo uma maior propensão de se diferenciar em os fenótipos mais maduros^25,26,28. Isto é pode ser devido à migração ventral para dorsal das células GRP nascentes, que poderão ser menos receptiva para as pistas de diferenciação. Immunopanning permite a subpopulação que expressa A2B5 a ser isolado e recolhido para manutenção em cultura.</p><p class="jove_content"> As nossas culturas de rato GRP são derivadas de tecido da medula espinal que produz total de uma população, heterogénea agrupada de células a partir do qual as células são seleccionadas por GRP química (médio) e técnicas de anticorpo com base. Enquanto os nossos estudos têm utilizado a medula espinhal células de ratinho derivados GRP, que mais recentemente tem sido relatada a derivação de cérebro de rato derivados de células progenitoras de oligodendrócitos que também são capazes de se desenvolver em oligodendrócitos maduros³¹. Aqui, as células derivadas são inicialmente cultivados como oligospheres que a utilização do meio de cultura apropriado são manipulados em um PDGFαR enriquecido +, a população de OPC³¹. Os nossos estudos têm-se centrado sobre o efeito do nosso modelo de hipóxico-isquémico insulto em células no espectro de linhagem oligodendrócito de A2B5 + e PDGFαR-GRP precursores para a proteína básica da mielina (MBP expressando +) oligodendrócitos maduros. Na verdade, nossa<em> In vitro</emCaracterização> mostrou essas células imaturas GRP amadurecem como células que expressam MBP ou em monoculturas ou em co-culturas com neurônios corticais. Estas células podem ser manipuladas em cultura em vias de diferenciação específicos para estudar os mecanismos envolvidos na lesão da substância perinatal branco. Existem vários modelos de ratos de doenças substância branca, envolvendo células da linhagem de oligodendrócitos ea disponibilidade desta população permite investigação exaustiva aos mecanismos que causam lesão, bem como para explorar a utilidade de opções terapêuticas possíveis de células.</p

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ F12 1:1	Invitrogen	11320033
B27	Invitrogen	17504044
N2	Invitrogen	17502048
rH-FGF-basic	Invitrogen	PHG0026
Trypsin (0.05%) EDTA	Quality Biological, Inc.	118-087-721
POLY-L-LYSINE HBr	Sigma	P1274-25MG
Laminin	Sigma	L2020-1MG
Dnase 1	Sigma	DN25