Visualisation des vasculaire Ca 2 + Signalisation Déclenchée par paracrine Dérivé ROS
Summary
Une méthode efficace pour mieux comprendre en visualisant l'induction paracrine dérivés du ROS endothéliales de signalisation Ca2 + est décrite. Cette méthode prend avantage de mesurer paracrine dérivés ROS déclenché la mobilisation de Ca2 + dans les cellules endothéliales vasculaires dans un modèle de co-culture.
Abstract
Le stress oxydatif a été impliquée dans un certain nombre de conditions pathologiques, y compris une ischémie / reperfusion dommages et la septicémie. Le concept de stress oxydatif se réfère à la formation aberrante de ROS (espèces réactives de l'oxygène), qui comprennent O 2 • -, H 2 O 2, et les radicaux hydroxyles. Espèces d'oxygène réactif influences d'une multitude de processus cellulaires, y compris la transduction du signal, la prolifération cellulaire et 1-6 la mort cellulaire. ROS ont le potentiel de dommages vasculaires et les cellules des organes directement, et peuvent initier des réactions chimiques secondaires et des altérations génétiques qui aboutissent à une amplification du dommage tissulaire ROS médiée initiale. Un élément clé de la cascade d'amplification qui exacerbe les dommages tissulaires irréversibles est le recrutement et l'activation de la circulation des cellules inflammatoires. Durant l'inflammation, les cellules inflammatoires produisent des cytokines comme facteur de nécrose tumorale α-(TNF) et de l'IL-1 quiactiver les cellules endothéliales (CE) et les cellules épithéliales et augmenter encore les 7 réponse inflammatoire. La dysfonction endothéliale vasculaire est un élément bien établi de l'inflammation aiguë. Les macrophages contribuent à la dysfonction endothéliale lors de l'inflammation par des mécanismes qui restent obscures. Activation des résultats des macrophages dans la libération extracellulaire de O 2 • – et diverses cytokines pro-inflammatoires, ce qui déclenche la signalisation pathologique dans les cellules adjacentes 8. NADPH oxydases sont la principale source de ROS et primaire dans la plupart des types cellulaires. Récemment, il est démontré par nous et d'autres que les ROS 9,10 produites par NADPH oxydases induire la production mitochondriale de ROS au cours de nombreuses conditions physiopathologiques. Ainsi la mesure de la production mitochondriale de ROS est tout aussi important en plus de mesurer cytosolique ROS. Les macrophages produisent des ROS par la NADPH oxydase flavoprotéine enzyme qui joue un rôle primordial dans l'inflammation. Une fois activé,NADPH oxydase phagocytaire produit de grandes quantités d'O 2 • – qui sont importants dans le mécanisme de défense de l'hôte 11,12. Bien paracrine dérivés O 2 • – joue un rôle important dans la pathogenèse des maladies vasculaires, la visualisation des paracrine ROS induite signalisation intracellulaire incluant mobilisation du Ca2 + est encore l'hypothèse. Nous avons développé un modèle dans lequel les macrophages activés sont utilisés comme une source d'O 2 • – pour transduire un signal pour les cellules endothéliales adjacentes. En utilisant ce modèle, nous démontrons que les macrophages dérivés de O 2 • – conduire à la signalisation calcique dans les cellules endothéliales adjacentes.
Protocol
Discussion
La méthode décrite ici permet une mesure rapide et quantitative des espèces réactives de l'oxygène dans les cellules vivantes en utilisant soit des colorants d'oxydation ou de capteurs sensibles plasmide. Les agonistes des récepteurs TLR (Toll-like receptors) sont des composés qui stimulent les cellules à travers le TLR présents sur la surface des cellules et déclencher les voies de signalisation en aval 15. Dans notre protocole, nous avons utilisé trois différents TLR savoir agonistes, Li…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health subvention (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) à MM. Notre article est en partie soutenue par Carl Zeiss LLC micro-imagerie.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
References
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