Multiplexed enkelt-molekyle Tving proteolyse målinger ved hjælp Magnetiske Pincetter
Summary
I denne artikel vil vi beskrive brugen af magnetiske pincet for at studere effekten af kraft på enzymatisk proteolyse på enkelt molekyle niveau i en meget parallelizable måde.
Abstract
Generering og detektering af mekaniske kræfter er en allestedsnærværende del af celle fysiologi, med direkte relevans til kræft metastase 1, atherogenese 2 og sårheling 3. I hvert af disse eksempler, såvel celler udøver kraft på deres omgivelser og samtidig enzymatisk remodel den ekstracellulære matrix (ECM). Effekten af kræfter på ECM er således blevet et område af stor interesse på grund af dets sandsynlige biologiske og medicinske betydning 4-7.
Enkelt molekyle teknikker, såsom optisk indfangning 8, atomic force microscopy 9, og magnetiske pincet 10,11 give forskere at undersøge funktionen af enzymer på molekylært niveau ved at udøve kræfter på individuelle proteiner. Af disse teknikker, er magnetiske pincet (MT), kendt for deres lave omkostninger og høj kapacitet. MT udøve kræfter i området på ca 1 til 100 PN og kan tilvejebringe millisekund tidsmæssige opløsning,egenskaber, der passer godt til studiet af enzymet mekanisme på enkelt-molekyle niveau 12. Her rapporterer vi en meget parallelizable MT assay for at studere virkningen af kraft på proteolyse af enkelte proteinmolekyler. Vi præsenterer det specifikke eksempel af proteolyse af et trimert collagen peptid ved matrixmetalloproteinase 1 (MMP-1), men kan dette assay kan let tilpasses til at studere andre substrater og proteaser.
Protocol
Discussion
Denne protokol beskrives en ny anvendelse af en klassisk enkelt molekyle teknik. Magnetiske pincet giver medium til høj kapacitet enkelt molekyle analyser på en omkostningseffektiv måde. Men ligesom alle eksperimentelle teknikker der er udfordringer og potentielle faldgruber.
Begrænsninger af magnetiske pincetter
Sammenlignet med en optisk fælde den rumlige og tidslige opløsning af en MT apparat er lav. Endvidere er de kræfter, der genereres af den simple MT …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Burroughs Wellcome Career Award på Den Videnskabelige Interface (ARD), National Institutes of Health via NIH direktørens New Innovator Award Program 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), og Stanford Cardiovascular Institute Younger Predoctoral Fellowship (JC). Forfatterne takker James Spudich for udlåner mikroskopi udstyr.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
