Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l'utilisation de pinces magnétiques
Summary
Dans cet article, nous décrivons l'utilisation de pinces magnétiques pour étudier l'effet de la force sur la protéolyse enzymatique à l'échelle de la molécule unique d'une manière hautement parallélisables.
Abstract
La génération et la détection des forces mécaniques est un aspect omniprésent de la physiologie cellulaire, en rapport direct avec le cancer métastatique 1, 2 et athérogenèse cicatrisation de la plaie 3. Dans chacun de ces exemples, les cellules à la fois exercer une force sur leur environnement et, simultanément, par voie enzymatique de remodeler la matrice extracellulaire (MEC). L'effet des forces sur ECM est donc devenue un domaine d'intérêt considérable en raison de son importance biologique et médicale susceptible 4-7.
Techniques molécules simples telles que le piégeage optique 8, microscopie à force atomique 9, et des pinces magnétiques 10,11 permettre aux chercheurs de sonder la fonction des enzymes au niveau moléculaire en exerçant des forces sur les protéines individuelles. Parmi ces techniques, pinces magnétiques (MT) sont remarquables par leur faible coût et à haut débit. MT exercer des forces dans la gamme de ~ 1-100 pN et peut fournir milliseconde résolution temporelle,qualités qui sont bien adaptés à l'étude du mécanisme enzymatique à la molécule seul niveau 12. Nous rapportons ici un test MT hautement parallélisable pour étudier l'effet de la force sur la protéolyse de molécules de protéines uniques. Nous présentons l'exemple spécifique de la protéolyse d'un peptide de collagène trimérique par la matrice métalloprotéinase 1 (MMP-1); cependant, ce test peut être facilement adapté à l'étude d'autres substrats et des protéases.
Protocol
Discussion
Ce protocole décrit une nouvelle utilisation d'une technique seule molécule classique. Pinces magnétiques permettent à moyen et à haut débit des tests de molécules simples d'une manière rentable. Cependant, comme toutes les techniques expérimentales il ya des défis et les pièges potentiels.
Limitations de pinces magnétiques
Par rapport à un piège optique de la résolution spatiale et temporelle d'un appareil de MT est faible. En outre, les …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Prix de carrière Burroughs Wellcome à l'interface scientifique (ARD), le National Institutes of Health à travers le directeur du NIH Programme Innovateur Prix Nouveau 1-DP2-OD007078 (ARD), le William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), et le Stanford Cardiovascular Institute Jeune bourse pré-doctorale (JC). Les auteurs tiennent à remercier James pour le prêt Spudich équipement de microscopie.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
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