Summary

Een 3D-systeem voor het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in gewrichtsvloeistof

Published: January 31, 2012
doi:

Summary

Een 3D-systeem van het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in hoge mate van gewrichtsvocht wordt beschreven. Gewrichtsvocht geeft de meest natuurlijke micro-omgeving voor het kraakbeen, en kan gemakkelijk worden verkregen en opgeslagen. Dit systeem kan dus gebruikt worden voor het bestuderen van het herstel van kraakbeen en voor het screenen van geneesmiddelen voor de behandeling van artritis.

Abstract

Kraakbeendestructie is een centraal pathologisch kenmerk van artrose, een belangrijke oorzaak van invaliditeit in de VS. Kraakbeen in de volwassen niet zeer efficiënt regenereren in vivo, en als gevolg daarvan, artrose leidt tot een onomkeerbaar verlies van kraakbeen en wordt begeleid door chronische pijn en immobiliteit 1,2. Kraakbeen tissue engineering biedt veelbelovende mogelijkheden om zich te vernieuwen en te herstellen weefsel functie. Deze technologie houdt doorgaans zaaien chondrocyten in natuurlijke of synthetische steigers en het kweken van de daaruit voortvloeiende 3D ​​in een evenwichtige medium te bouwen over een periode van tijd met een doel van techniek een biochemisch en biomechanisch volwassen weefsel dat kan tot een defect site getransplanteerd in vivo 3-6 . Het bereiken van een optimale conditie voor de chondrocyten groei en matrix depositie is essentieel voor het succes van het kraakbeen tissue engineering.

In de inheemse gewrichtsholte, kraakbeen bij de articheid oppervlak van het bot is badend in gewrichtsvloeistof. Deze duidelijke en viskeuze vloeistof levert voedingsstoffen aan het avasculaire kraakbeen en bevat groeifactoren, cytokines en enzymen die belangrijk zijn voor chondrocyten stofwisseling 7,8. Bovendien, gewrichtsvocht vergemakkelijkt lage wrijving beweging tussen kraakbeen vlakken vooral door afscheidende twee belangrijke componenten, hyaluronzuur en lubricin 9 10. In tegenstelling, is weefselmanipulatieproduct kraakbeen meestal gekweekt in kunstmatige media. Hoewel deze media zijn waarschijnlijk in staat om meer gedefinieerde voorwaarden voor het bestuderen van chondrocyte stofwisseling te bieden, gewrichtsvocht het meest nauwkeurig weerspiegelt de natuurlijke omgeving van die articulaire chondrocyten wonen inch

Inderdaad, gewrichtsvocht heeft het voordeel dat het gemakkelijk te verkrijgen en op te slaan, en kunnen vaak regelmatig worden aangevuld door het lichaam. Verschillende groepen hebben het kweekmedium aangevuld met gewrichtsvocht in het kweken van menselijke, rund, konijn en hond chondrocytes, maar meestal alleen gebruikt lage niveaus van gewrichtsvloeistof (minder dan 20%) 11-25. Terwijl de kip, paard en menselijke chondrocyten werden gekweekt in het medium met een hoger percentage van de synoviale vloeistof, deze cultuur systemen waren twee-dimensionale 26-28. Hier presenteren we onze manier van kweken van menselijke articulaire chondrocyten in een 3D-systeem met een hoog percentage van de gewrichtsvloeistof (tot 100%) over een periode van 21 dagen. Daarbij hebben we een belangrijke hindernis overwonnen door de hoge viscositeit van de gewrichtsvloeistof. Dit systeem biedt de mogelijkheid van een studie van de menselijke chondrocyten in synoviaal vocht in een 3D-omgeving, die verder kan worden gecombineerd met twee andere belangrijke factoren (zuurstofspanning en mechanische belasting) 29,30, dat de natuurlijke omgeving vormen voor het kraakbeen aan het natuurlijke milieu na te bootsen voor kraakbeen groei. Bovendien kan dit systeem ook worden gebruikt voor het testen van gewrichtsvloeistof activiteit op chondrocyten en bieden een platform voor het ontwikkelen vanherstel van kraakbeen technologieën en therapeutische opties voor artritis.

Protocol

Een 3D-systeem voor het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in gewrichtsvloeistof In dit werk hebben we ingekapseld menselijke articulaire chondrocyten in alginaat kralen met behulp van een aangepaste productie-stelde voor inkapseling protocol (Lonza, en 31). Met behulp van deze 3D-constructies, hebben we een systeem ontwikkeld voor het kweken van cellen in een kweekmedium met uiteenlopende percentages van de menselijke gewrichtsvloeistof en hebben tevens deze 3D-constr…

Discussion

In dit rapport hebben we een methode ontwikkeld die voor de cultuur van de menselijke articulaire chondrocyten kan in een 3D omgeving in medium dat hoge concentraties van het menselijk synoviaal vocht bevat. Gewrichtsvocht is een van de belangrijkste componenten die de natuurlijke omgeving vormen in de gewrichtsholte, waar articulaire chondrocyten wonen. Echter, de viscositeit van de gewrichtsvloeistof is een grote uitdaging voor drie-dimensionale de lange termijn kweken van chondrocyten. Om het overwinnen van de uitdag…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen graag Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura en Dana Cairns (Tufts University) te bedanken voor het verstrekken van hulp bij het gewrichtsvloeistof opslag en centrifugeren. Dit werk werd gefinancierd door de NIH (1R01AR059106-01A1) voor LZ

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments
Alginate (Alginic Acid sodium salt) Sigma A2158-250G 2.4% solution stored at 40°C
Calcium Chloride Dihydrate, Granular J.T. Baker A19339
Chondrogenic Growth media Lonza CC-3156 (base media)  
CC-4409 (supplement)
Chondrogenic Differentiation Media Lonza CC-3226 (base media)  
CC-4408 (supplement)
Human articular chondrocytes Lonza CC-2550
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma-Aldrich D9542
RNeasy mini kit (for RNA extraction) Qiagen 74104
PCR reagents: SYBR-green Quanta 95053-500
12 ml syringe Tyco-Kendall-Monoject 512852
22-Gague Hypodermic Needle Tyco-Kendall-Monoject 8881
Microscope Olympus IX71
Platform rocker Thermoscientific thermolyne Vari-mix
       
Primers sequences
Collagen IIa-forward 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′
Collagen IIa-reverse 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′
MMP13-forward 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′
MMP13-reverse 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′
Caspase 3-forward 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′
Caspase 3-reverse 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′

References

  1. Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations–United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
  2. Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
  3. Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
  4. Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
  5. Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
  6. Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
  7. Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
  8. Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
  9. Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
  10. Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
  11. van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
  12. Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
  13. Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
  14. Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
  15. Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
  16. Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
  17. Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
  18. Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
  19. Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
  20. Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
  21. Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
  22. Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
  23. Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
  24. Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
  25. Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
  26. Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
  27. van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
  28. Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
  29. Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
  30. Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
  31. Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
  32. Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
  33. Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
  34. Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
  35. Anat, J. . 121, 107-118 (1976).
check_url/3587?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Brand, J. A., McAlindon, T. E., Zeng, L. A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid. J. Vis. Exp. (59), e3587, doi:10.3791/3587 (2012).

View Video