Een 3D-systeem van het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in hoge mate van gewrichtsvocht wordt beschreven. Gewrichtsvocht geeft de meest natuurlijke micro-omgeving voor het kraakbeen, en kan gemakkelijk worden verkregen en opgeslagen. Dit systeem kan dus gebruikt worden voor het bestuderen van het herstel van kraakbeen en voor het screenen van geneesmiddelen voor de behandeling van artritis.
Kraakbeendestructie is een centraal pathologisch kenmerk van artrose, een belangrijke oorzaak van invaliditeit in de VS. Kraakbeen in de volwassen niet zeer efficiënt regenereren in vivo, en als gevolg daarvan, artrose leidt tot een onomkeerbaar verlies van kraakbeen en wordt begeleid door chronische pijn en immobiliteit 1,2. Kraakbeen tissue engineering biedt veelbelovende mogelijkheden om zich te vernieuwen en te herstellen weefsel functie. Deze technologie houdt doorgaans zaaien chondrocyten in natuurlijke of synthetische steigers en het kweken van de daaruit voortvloeiende 3D in een evenwichtige medium te bouwen over een periode van tijd met een doel van techniek een biochemisch en biomechanisch volwassen weefsel dat kan tot een defect site getransplanteerd in vivo 3-6 . Het bereiken van een optimale conditie voor de chondrocyten groei en matrix depositie is essentieel voor het succes van het kraakbeen tissue engineering.
In de inheemse gewrichtsholte, kraakbeen bij de articheid oppervlak van het bot is badend in gewrichtsvloeistof. Deze duidelijke en viskeuze vloeistof levert voedingsstoffen aan het avasculaire kraakbeen en bevat groeifactoren, cytokines en enzymen die belangrijk zijn voor chondrocyten stofwisseling 7,8. Bovendien, gewrichtsvocht vergemakkelijkt lage wrijving beweging tussen kraakbeen vlakken vooral door afscheidende twee belangrijke componenten, hyaluronzuur en lubricin 9 10. In tegenstelling, is weefselmanipulatieproduct kraakbeen meestal gekweekt in kunstmatige media. Hoewel deze media zijn waarschijnlijk in staat om meer gedefinieerde voorwaarden voor het bestuderen van chondrocyte stofwisseling te bieden, gewrichtsvocht het meest nauwkeurig weerspiegelt de natuurlijke omgeving van die articulaire chondrocyten wonen inch
Inderdaad, gewrichtsvocht heeft het voordeel dat het gemakkelijk te verkrijgen en op te slaan, en kunnen vaak regelmatig worden aangevuld door het lichaam. Verschillende groepen hebben het kweekmedium aangevuld met gewrichtsvocht in het kweken van menselijke, rund, konijn en hond chondrocytes, maar meestal alleen gebruikt lage niveaus van gewrichtsvloeistof (minder dan 20%) 11-25. Terwijl de kip, paard en menselijke chondrocyten werden gekweekt in het medium met een hoger percentage van de synoviale vloeistof, deze cultuur systemen waren twee-dimensionale 26-28. Hier presenteren we onze manier van kweken van menselijke articulaire chondrocyten in een 3D-systeem met een hoog percentage van de gewrichtsvloeistof (tot 100%) over een periode van 21 dagen. Daarbij hebben we een belangrijke hindernis overwonnen door de hoge viscositeit van de gewrichtsvloeistof. Dit systeem biedt de mogelijkheid van een studie van de menselijke chondrocyten in synoviaal vocht in een 3D-omgeving, die verder kan worden gecombineerd met twee andere belangrijke factoren (zuurstofspanning en mechanische belasting) 29,30, dat de natuurlijke omgeving vormen voor het kraakbeen aan het natuurlijke milieu na te bootsen voor kraakbeen groei. Bovendien kan dit systeem ook worden gebruikt voor het testen van gewrichtsvloeistof activiteit op chondrocyten en bieden een platform voor het ontwikkelen vanherstel van kraakbeen technologieën en therapeutische opties voor artritis.
In dit rapport hebben we een methode ontwikkeld die voor de cultuur van de menselijke articulaire chondrocyten kan in een 3D omgeving in medium dat hoge concentraties van het menselijk synoviaal vocht bevat. Gewrichtsvocht is een van de belangrijkste componenten die de natuurlijke omgeving vormen in de gewrichtsholte, waar articulaire chondrocyten wonen. Echter, de viscositeit van de gewrichtsvloeistof is een grote uitdaging voor drie-dimensionale de lange termijn kweken van chondrocyten. Om het overwinnen van de uitdag…
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura en Dana Cairns (Tufts University) te bedanken voor het verstrekken van hulp bij het gewrichtsvloeistof opslag en centrifugeren. Dit werk werd gefinancierd door de NIH (1R01AR059106-01A1) voor LZ
Table of specific reagents and equipment:
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
Calcium Chloride Dihydrate, Granular | J.T. Baker | A19339 | |
Chondrogenic Growth media | Lonza | CC-3156 (base media) | |
CC-4409 (supplement) | |||
Chondrogenic Differentiation Media | Lonza | CC-3226 (base media) | |
CC-4408 (supplement) | |||
Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 | |
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
PCR reagents: SYBR-green | Quanta | 95053-500 | |
12 ml syringe | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
22-Gague Hypodermic Needle | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
Microscope | Olympus | IX71 | |
Platform rocker | Thermoscientific thermolyne | Vari-mix | |
Primers sequences | |||
Collagen IIa-forward | 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′ | ||
Collagen IIa-reverse | 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′ | ||
MMP13-forward | 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′ | ||
MMP13-reverse | 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′ | ||
Caspase 3-forward | 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′ | ||
Caspase 3-reverse | 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′ |