Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale
Summary
Un sistema 3D di coltura di condrociti articolari umani in alti livelli di liquido sinoviale è descritto. Liquido sinoviale riflette il microambiente più naturale per la cartilagine articolare, e può essere facilmente ottenuti e memorizzati. Questo sistema quindi può essere utilizzato per studiare la rigenerazione della cartilagine e per terapie di screening per il trattamento di artrite.
Abstract
Distruzione della cartilagine è un elemento centrale patologica di osteoartrite, una delle principali cause di disabilità negli Stati Uniti. La cartilagine nell'adulto non si rigenera in modo molto efficiente in vivo, e, di conseguenza, l'artrosi conduce alla irreversibile perdita della cartilagine ed è accompagnata da dolore cronico e 1,2 immobilità. Ingegneria dei tessuti cartilagine offre un potenziale promettente per rigenerare e ripristinare la funzionalità dei tessuti. Questa tecnologia in genere implica condrociti semina in ponteggi naturale o sintetica e la coltura del 3D che dà luogo a costruire un mezzo equilibrato per un periodo di tempo con l'obiettivo di un tessuto di ingegneria biochimica e biomeccanica mature che possono essere trapiantate in un sito difetto in vivo 3-6 . Raggiungere una condizione ottimale per la crescita dei condrociti e la deposizione della matrice è essenziale per il successo di ingegneria dei tessuti cartilaginei.
Nella nativa comune cavità, cartilagine al articcolare superficie dell'osso è immersa nel liquido sinoviale. Questo liquido chiaro e viscoso fornisce sostanze nutritive per la cartilagine articolare avascolare e contiene fattori di crescita, citochine e gli enzimi che sono importanti per il metabolismo dei condrociti 7,8. Inoltre, il liquido sinoviale facilita il movimento a basso attrito tra le superfici cartilaginee che secernono principalmente attraverso due componenti chiave, acido ialuronico e lubricin 9 10. Al contrario, la cartilagine di ingegneria tessutale è spesso colto in mezzi artificiali. Mentre questi media sono probabilmente in grado di offrire condizioni più definite per lo studio del metabolismo dei condrociti, liquido sinoviale più accuratamente riflette l'ambiente naturale di cui condrociti articolari risiedono in
Infatti, il liquido sinoviale ha il vantaggio di essere facile da ottenere e conservare, e che spesso può essere regolarmente rifornito dal corpo. Diversi gruppi hanno completato il terreno di coltura con liquido sinoviale in crescita umano, bovino, coniglio e cane chondrocytes, ma soprattutto utilizzato solo bassi livelli di liquido sinoviale (inferiore al 20%) 11-25. Mentre condrociti pollo, cavallo e umani sono stati colti nel mezzo con una maggiore percentuale di liquido sinoviale, questi sistemi di coltura erano bidimensionali 26-28. Qui vi presentiamo il nostro metodo di coltura di condrociti articolari umani in un sistema 3D con un alta percentuale di liquido sinoviale (fino al 100%) per un periodo di 21 giorni. Nel fare ciò, abbiamo superato un grande ostacolo presentato dalla viscosità del liquido sinoviale. Questo sistema offre la possibilità di studiare condrociti umani nel liquido sinoviale in un ambiente 3D, che può essere ulteriormente raggruppati con altri due importanti fattori (tensione di ossigeno e carico meccanico), 29,30 che costituiscono l'ambiente naturale per la cartilagine di imitare l'ambiente naturale per cartilagine di crescita. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato anche per saggiare l'attività del liquido sinoviale sui condrociti e fornire una piattaforma per lo sviluppotecnologie di rigenerazione della cartilagine e le opzioni terapeutiche per l'artrite.
Protocol
Discussion
In questo rapporto, abbiamo sviluppato un metodo che permette per la cultura dei condrociti articolari umani in un ambiente 3D in mezzo che contiene alte concentrazioni di liquido sinoviale umano. Liquido sinoviale è uno dei principali componenti che costituiscono l'ambiente naturale nella cavità articolare, dove risiedono condrociti articolari. Tuttavia, la viscosità del liquido sinoviale è stata una grande sfida per tridimensionali a lungo termine coltura di condrociti. Per superare la sfida di mantenere la di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura e Dana Cairns (Tufts University) per aver fornito aiuto di stoccaggio liquido sinoviale e centrifugazione. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (1R01AR059106-01A1) per LZ
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | J.T. Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Platform rocker | Thermoscientific thermolyne | Vari-mix | |
| Primers sequences | |||
| Collagen IIa-forward | 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′ | ||
| MMP13-forward | 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′ | ||
| MMP13-reverse | 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′ | ||
| Caspase 3-forward | 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′ | ||
| Caspase 3-reverse | 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′ |
References
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations–United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
- Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
- Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
- Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
- Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
- Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
- Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
- van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
- Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
- Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
- Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
- Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
- Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
- Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
- Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
- Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
- Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
- Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
- Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
- Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
- Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
- van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
- Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
- Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
- Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
- Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
- Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
- Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
- Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
- Anat, J. . 121, 107-118 (1976).
