Un système 3D pour les chondrocytes articulaires humains Culture dans le liquide synovial
Summary
Un système 3D de chondrocytes articulaires humains en culture dans les niveaux élevés du liquide synovial est décrite. Le liquide synovial reflète le microenvironnement plus naturelle pour le cartilage articulaire, et peut être facilement obtenu et stocké. Ce système peut donc être utilisée pour étudier la régénération du cartilage et de dépistage pour les thérapies pour traiter l'arthrite.
Abstract
Cartilage de destruction est un élément central pathologiques de l'arthrose, une des principales causes d'invalidité dans les Etats-Unis. Cartilage de l'adulte ne se régénère pas très efficace in vivo, et par conséquent, l'arthrose conduit à une perte irréversible du cartilage et est accompagné par la douleur chronique et 1,2 immobilité. Génie tissulaire du cartilage offre un potentiel prometteur pour régénérer et restaurer la fonction des tissus. Cette technologie implique généralement chondrocytes semis dans des échafaudages naturel ou synthétique et la culture de la 3D résultant de construire dans un milieu équilibré sur une période de temps avec un but de l'ingénierie biochimique et un tissu biomécaniquement matures qui peuvent être transplantées dans un site de la lésion in vivo 3-6 . Atteindre une condition optimale pour la croissance des chondrocytes et dépôt de matrice est essentiel pour la réussite de l'ingénierie tissulaire du cartilage.
Dans la cavité natale, conjointe du cartilage à l'articla surface de l'os EXCLUES baigne dans le liquide synovial. Ce liquide clair et visqueux fournit des nutriments au cartilage articulaire avasculaire et contient des facteurs de croissance, des cytokines et des enzymes qui sont importants pour le métabolisme des chondrocytes 7,8. Par ailleurs, le liquide synovial facilite faible coefficient de frottement entre les surfaces cartilagineuses mouvement principalement par sécrétant deux éléments clés, le hyaluronane et Lubricin 9 10. En revanche, l'ingénierie tissulaire du cartilage est le plus souvent cultivés en milieu artificiel. Bien que ces médias sont vraisemblablement en mesure d'offrir des conditions plus définies pour étudier le métabolisme des chondrocytes, le liquide synovial reflète le plus fidèlement l'environnement naturel, dont les chondrocytes articulaires résident po
En effet, le liquide synovial a l'avantage d'être facile à obtenir et à stocker, et peut souvent être régulièrement réapprovisionné par le corps. Plusieurs groupes ont complété le milieu de culture avec du liquide synovial dans la croissance humaine, bovine, lapin et chien chondrocytes, mais surtout utilisé seulement de faibles niveaux de liquide synovial (inférieur à 20%) 11-25. Alors que les chondrocytes de poulet, de cheval et humaines ont été cultivées dans le milieu avec des pourcentage plus élevé de liquide synovial, ces systèmes de culture ont été à deux dimensions 26-28. Ici, nous présentons notre méthode de culture de chondrocytes articulaires humains dans un système 3D avec un pourcentage élevé de liquide synovial (jusqu'à 100%) sur une période de 21 jours. Ce faisant, nous avons surmonté un obstacle majeur présenté par la haute viscosité du liquide synovial. Ce système offre la possibilité d'étudier des chondrocytes humains dans le liquide synovial, dans un cadre 3D, qui peut être combiné avec deux autres facteurs importants (la tension d'oxygène et le chargement mécanique) 29,30 qui constituent l'environnement naturel pour le cartilage d'imiter le milieu naturel pour la croissance du cartilage. Par ailleurs, ce système peut également être utilisé pour le dosage de l'activité du liquide synovial sur les chondrocytes et de fournir une plateforme pour le développementcartilage de technologies de régénération et les options thérapeutiques pour l'arthrite.
Protocol
Discussion
Dans ce rapport, nous avons développé une méthode qui permet la culture de chondrocytes articulaires humains dans un environnement 3D en milieu contenant des concentrations élevées de liquide synovial humain. Le liquide synovial est l'un des principaux composants qui constituent l'environnement naturel dans la cavité articulaire, où résident les chondrocytes articulaires. Cependant, la viscosité du liquide synovial a été un défi majeur pour trois dimensions à long terme de culture des chondrocytes. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura et Dana Cairns (Tufts University) pour fournir une aide au stockage du liquide synovial et la centrifugation. Ce travail a été financé par le NIH (1R01AR059106-01A1) pour LZ
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | J.T. Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Platform rocker | Thermoscientific thermolyne | Vari-mix | |
| Primers sequences | |||
| Collagen IIa-forward | 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′ | ||
| MMP13-forward | 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′ | ||
| MMP13-reverse | 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′ | ||
| Caspase 3-forward | 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′ | ||
| Caspase 3-reverse | 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′ |
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