Un rapido<em> In vivo</em> Test per verificare i composti neuromodulatori che utilizzano il sistema di Giant Fiber (GFS) di<em> Drosophila melanogaster</em> Descritto. Nanoinjections nella testa dell'animale insieme registrazioni elettrofisiologiche di GFS può rivelare la bioattività dei composti sui neuroni e muscoli.
Composti di screening per l'attività in vivo può essere utilizzato come un primo passo per identificare candidati che possono essere sviluppati in 1,2 agenti farmacologici. Abbiamo sviluppato un nanoinjection / elettrofisiologia nuovo metodo di analisi che permette il rilevamento di effetti modulatori di composti bioattivi sulla funzione di un circuito neuronale che media la risposta di fuga in Drosophila melanogaster 3,4. Il saggio in vivo, che utilizza la fibra Drosophila Giant System (GFS, Figura 1) permette lo screening dei vari tipi di composti, come piccole molecole o peptidi, e richiede quantità minime per provocare un effetto. Inoltre, il GFS Drosophila offre una grande varietà di potenziali bersagli molecolari sui neuroni e muscoli. Le fibre giganti (GFS) sinapsi elettricamente (Gap Junction) e chimicamente (colinergica) su una sinapsi Interneuron Peripheral (PSI) e il Trochanteral Tergo Muscle neurone (TTMn) 5 </sup>. Il PSI di DLMn (dorsale neurone muscolare longitudinale) la connessione dipende Dα7 recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChR) 6. Infine, la giunzioni neuromuscolari (NMJ) del TTMn e la DLMn con il salto (TTM) e dei muscoli di volo (DLM) sono glutamatergica 7-12. Qui, si dimostra come iniettare quantità nanolitri di un composto, ottenendo registrazioni elettrofisiologiche intracellulari dal sistema fibra Giant 13 e come controllare gli effetti del composto sulla funzione di questo circuito. Mostriamo la specificità del test con citrato methyllycaconitine (MLA), un antagonista nAChR, che interrompe il PSI di DLMn connessione, ma non il GF a TTMn connessione o la funzione del NMJ al salto o dei muscoli del volo.
Prima di iniziare questo video, è fondamentale che si guarda con attenzione e familiarizzare con il video intitolato "JOVE registrazioni elettrofisiologiche dal sentiero fibra gigante di D. Melanogaster "da Augustin et al 7, come il video presentato qui è inteso come un ampliamento di questa tecnica esistente. Qui si utilizza il metodo elettrofisiologico registrazioni e focalizzazione in dettaglio solo l'aggiunta delle nanoinjections accoppiati e la tecnica di monitoraggio.
Il nanoinjection / elettrofisiologia biotest qui presentata consente un rapido screening di composti nel sistema nervoso del moscerino della frutta. Si tratta di una nuova tecnica in vivo che richiede piccole quantità di un composto per provocare un effetto su una varietà di bersagli molecolari in un circuito ben caratterizzato neuronale. Questo metodo può essere utilizzato per testare la bioattività di diversi composti, da tossine sconosciuti agenti farmacologici disponibili in commercio.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Mari e il laboratorio Godenschwege, in particolare Aline Yonezawa, per i commenti e aiutare con questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto Nazionale per la Neurological Disorder and Stroke concessione R21NS06637 di FM e TAG, AB è stato finanziato dalla National Science il premio Foundation numero 082925, URM: Biologia Integrativa per i futuri ricercatori.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
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Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
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Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |