Neurite 가지의 Assays에 대한 해부와 칙 Statoacoustic 신경절과 콜라겐 젤에서 척수의 Explants의 문화
Summary
우리는 병아리 E4 statoacoustic 신경절 및 E6 척수의 explants을 해부하다 문화하는 방법을 보여줍니다. Explants는 24 시간 동안 3D 콜라겐 젤의 혈청 무료 조건에서 양식입니다. Neurite 대응은 성장 인자 – 보충 매체와 단백질 코팅 비즈와 함께 테스트됩니다.
Abstract
닭 내이 (内耳)의 감각 기관은 statoacoustic 신경절 (SAG) 뉴런의 주변 장치 프로세스에 의해 innervated 있습니다. 감각 기관의 innervation이 성장 axons 및 / 궤도를 따라 그들의 감각 기관 목표 내에 축삭 안내 단서 1과 생존 요인 2 조합에 따라 달라집니다. 예를 들어, 전형적인 축삭지도 신호 경로, semaphorin – neuropilin와 기능 간섭은 귀의 axons 3 misrouting 생성. 또한, 여러 가지 성장 요인 Neurotrophin – 3 (NT – 3) 및 뇌 유래 Neurotrophic 팩터 (BDNF)를 포함 내이의 감각 대상, 표현하는 것은 다시 SAG의 axons 4 misrouting로 이어지는, 유전자 변형 동물에 조작되었습니다. 이 같은 분자 체외 5,6의 생존과 여자는 SAG의 뉴런의 neurite의 파생물을 모두 추진하고 있습니다.
여기서는 설명하고 체외 방법에서 현재 U있는 입증알려진 같은 Wnts 같은 morphogens뿐만 아니라, SAG의 neurite의 파생물 및 신경 세포 생존을 촉진에 중요한 성장 요인을 포함하여 가용성 단백질에 여자는 SAG의 neurites의 반응을 테스트하는 노래. 이 모델 시스템을 사용하여, 우리는 분비 리간드는 SAG의 신경 세포의 생존과 neurite의 파생물에 견딜수 수있는 효과에 대한 결론을 그릴 수 있도록 최선을 다하겠습니다.
SAG의 explants은 배아 일 4 (E4)에 해부 및 24 시간 동안 혈청이없는 조건 입체 콜라겐 젤의 양식입니다. 첫째, neurite 응답은 단백질 보충 매체 culturing의 explants에 의해 테스트됩니다. 그런 다음 분비 리간드의 포인트 소스 neurite 가지에 대한 방향성 영향을 미칠 수 있는지 여부를 물어, explants는 단백질 코팅 비즈와 공동 교양 및 지역 홍보 또는 파생물을 억제하기 위해 비드의 능력에 대한 assayed 있습니다. 우리는 또한 해부의 실연 (7 번 프로토콜 수정) 및 E6 척수의 explants 문화를 포함합니다. 우리정기적으로 단백질과 단백질 절어 구슬의 bioactivity을 확인하기 척수의 explants를 사용하고 SAG의 explants 같은 문화 조건에서, 병아리, 조직과 종에게 교차 반응을 확인할 수 있습니다. 시험 관내 assays에서 이들은 신속 특히 생체내에서 연구를 수행하기 전에, 영양 (생존) 또는 SAG의 뉴런에서 열대 (방향) 효과를 발휘 분자에 대한 심사를위한 편리합니다. 또한,이 방법은 높은 신경 세포의 생존 8, 혈청이없는 조건에서 각각의 분자의 테스트를 수 있습니다.
Protocol
Discussion
우리는 혈청이없는 조건에서, 병아리의, 문화 E4의 SAG와 E6 척수의 explants을 해부하다하고 방법을 제시한다. 이 절차는 현재 SAG의 신경 세포의 생존과 neurite의 파생물에 대한 다양한 분비 리간드의 효과를 연구하기 위해 연구실에서 사용됩니다. 이 프로토콜의 소설 측면 culturing의 explants와 SAG의 neurite의 파생물에 대한 효과를 연구하기 위해 성장 요인에 배어 구슬의 사용을위한 혈청없는 시스템의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 그랜트 RO1DC002756 국립 연구소와 Purdue 학술 진흥 재단에 의해 투자되었다. 우리는 실험과 수치과 관련하여 도움이 로드니의 McPhail와 조언 도리스 우와 Wiese 장 감사드립니다.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
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| Dissection microscope |
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We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
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| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
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| Dissection Materials |
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| Sylgard© coated petri dish |
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| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
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| E4 and E6 chicken eggs |
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| Chick Ringer’s solution |
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Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
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| Collagen preparation |
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| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
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To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
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| Explant culture |
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| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
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| Immunohistochemistry |
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| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
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Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
References
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