En metode til betinget knockdown et mål protein uttrykk i voksen sebrafisk netthinnen er beskrevet, som innebærer intravitreally injisere antisens morpholinos og electroporating dem inn i netthinnen. Den resulterende protein er slått ned i flere dager, noe som gjør testing av protein rolle i regenerere eller intakt netthinne.
Mange ødeleggende arvelige øyesykdommer resultere i progressive og irreversible blindhet fordi mennesker ikke kan regenerere døde eller syke retinal nerveceller. I kontrast, besitter den voksne sebrafisk netthinnen den robust evne til spontant regenerere noen neuronal klasse som er tapt i en rekke forskjellige retinal skade modeller, inkludert retinal punktering, kjemiske ablasjon, konsentrert høy temperatur, og intense lysbehandling 1-8. Vår lab utstrakt preget regenerering av fotoreseptorene følgende konstant intens lysbehandling og indre retinal nevroner etter intravitreal ouabain 2 injeksjon, 5, 9. I alle tilfeller, bosatt Müller gliaceller re-gå inn i cellen syklus å produsere nevrale stamceller, som fortsetter å spre seg og migrere til riktig retinal lag, hvor de differensieres til den mangelfulle nerveceller.
Vi karakterisert fem forskjellige stadier under regenerering av lys-damaGED netthinnen som ble fremhevet av spesifikke cellulære responser. Vi identifiserte flere differensielt uttrykte gener på hvert stadium av retinal regenerering av mRNA microarray analyser 10. Mange av disse genene er også avgjørende for utvikling av synet. For å teste hvilken rolle hver kandidat gen / protein i løpet av retinal regenerasjon, trengte vi å utvikle en metode for å betinget begrense uttrykket av en kandidat protein bare til tider under regenerering av den voksne netthinnen.
Morpholino oligos er mye brukt til å studere tap av funksjon av spesifikke proteiner under utviklingen av sebrafisk, Xenopus, kylling, mus, og svulster i menneskelig xenografts 11-14. Disse modifiserte oligos basepair med komplementære RNA sekvensen enten blokkere spleising eller oversettelse av målet RNA. Morpholinos er stabile i cellen og kan eliminere eller "knockdown" protein uttrykk i tre til fem dager 12.
Hervi beskriver en metode for å effektivt knockdown mål protein uttrykk i den voksne sebrafisk netthinnen. Denne metoden benytter lissamine-merkede antisens morpholinos som er injisert i glasslegemet av den voksne sebrafisk øyet. Ved hjelp av elektroder tang, er morpholino da electroporated i alle celletyper i dorsal og sentrale netthinnen. Lissamine gir ladningen på morpholino for electroporation og kan visualiseres å vurdere tilstedeværelse av morpholino i netthinnens celler.
Betinget knockdown i netthinnen kan brukes til å undersøke betydningen av spesifikke proteiner til ulike tider i løpet av regenerering. I tillegg kan denne tilnærmingen brukes til å studere rollen til spesifikke proteiner i uskadet netthinnen, i slike prosesser som visuelle transduksjon og visuell prosessering i andre ordens nevroner.
Nylig undersøkte to microarray analyser av genuttrykk endringene som oppstod under regenerering av enten lys-skadet netthinnen eller en kirurgisk-excised retinal patch 10, 16. Begge studiene viste en rekke gener som viste signifikante endringer i uttrykk, enten øker eller reduserer, som sannsynligvis er nødvendig for forskjellige hendelser som skjer under retinal regenerasjon, som re-entry av Müller gliaceller inn i cellen syklus, fortsatte spredning og migrasjon av neuronal stamfedre til den skadede retinal laget, og differensiering av nevrale stamceller i riktig nevronale celletype. Mens en direkte sammenligning av disse to microarray datasettene avslører kandidat gener som kan være involvert i disse cellulære begivenhetene, til slutt disse genene og deres kodet proteiner må testes for å avgjøre om de er nødvendige for neuronal regenerasjon. Her beskriver vi et kraftig tap-av-funksjon tilnærming til conditionalt knockdown proteiner av interesse i den voksne sebrafisk netthinnen. Denne teknikken har blitt brukt til å studere både ekstracellulære og intracellulære proteiner, samt signalmolekyler, transkripsjonsfaktorer og proteiner som kreves for DNA replikasjon 17-19. Dermed har denne metoden i stor grad hjulpet vår forståelse av den molekylære mekanismen underliggende voksen retinal regenerering i sebrafisk.
Vi testet flere electroporation parametre (spenning, antall pulser, tid mellom pulser) før en vellykket protokoll ble oppnådd. En tidligere rapport om electroporating morpholinos i regenererende sebrafisk caudal fin brukt 10 pulser ved lav spenning (15 V) 20. Fordi voksen sebrafisk netthinnen er omgitt av flere cellelag og er ikke lett tilgjengelig for Pinsett elektroder, ble parametrene brukt i fin mislykkede ved effektivt electroporating morpholinos inn i voksen netthinnen. Motsatt vil en høy spenning (100 V) ofte resulted i døden for fisken. Nylig, 5 pulser av 80 V ble beskrevet å electroporate plasmid DNA inn i nyfødte mus valp netthinnen 21. Vi fant at en litt mindre intens 2 pulser av 75 V resulterte i vellykket electroporation av morpholinos inn i den voksne sebrafisk netthinnen med overlevelse på 100% av de behandlede fisken. I tillegg oppdaget vi at fjerningen av den ytterste (eller ekstern-mest) komponent av hornhinnen betydelig økt electroporation effektivitet. Øke antall pulser kan eliminere behovet for fjerning av dette vevet, men kan også føre til større vevsskade. Omfattende kontroll studier vist at disse parametrene ikke medføre noen vesentlig retinal celledød eller endre spesifikke cellulære responser observert under fotoreseptor regenerering 19. Gain-of-funksjon studier er for øyeblikket ikke mulig å bruke denne teknikken in vivo, på grunn av manglende evne våre å konsekvent electroporate store ribonucleic syrer i alle retinal celler. Imidlertid antyder suksess electroporating plasmider inn musen netthinnen in vivo og sebrafisk netthinnen i explants det er fortsatt en mulighet i 21 sebrafisk, 22.
En av styrkene til denne teknikken er electroporation ser ut til å effektivt introdusere morpholino inn alle de forskjellige retinal celletyper. Imidlertid var en potensiell svakhet at electroporation effektivt leverte morpholino inn bare de dorsale og sentrale retinal regioner. En annen electroporation event mot ventrale halvdelen av netthinnen resulterer i god rettet til alle lag, men ofte resulterer i skade. Denne romlige restriksjonen sannsynlig skyldtes form og plassering av elektrodene. Bruken av spesialdesignede kopp formet elektroder som kan plasseres rundt øyet kan forbedre denne svakheten. Denne romlig begrensning av morpholino levering begrenser bruken av denne teknikken, og utelukker bruk av en analyse lykkesh som ERG analyse som ville kreve en global vurdering av netthinnen. Det bør bemerkes at som med alle morpholino eksperiment, er det tilrådelig å bekrefte resultater ved hjelp av en annen, ikke-overlappende morpholino til målet mRNA. I noen tilfeller er det mulig å også electroporate to forskjellige morpholinos samtidig for å knockdown uttrykk for to forskjellige proteiner. Vi viste dette ved å slå ned uttrykket av både Pax6a og Pax6b proteiner, enkeltvis og i kombinasjon 18 år.
Selv om vi demonstrerte bruken av denne teknikken med våre lys skademodell, kan det trolig bli brukt til å studere regenerering i annen skade modeller 2-8 eller brukt til å undersøke funksjonen av proteiner i uskadet netthinnen. For eksempel kan electroporation av morpholinos brukes til knockdown uttrykket av bestemte kanaler eller signal transduksjon molekyler i ganglion eller amacrine celler og deretter studere funksjonen til disse signaleringstier i visuell prosessering. Men som morpholinos bare påvirker oversettelsen av nye protein, ville man vente til endogent protein omsetningen skjer før en analyse kunne utføres. Avhengig av stabiliteten av proteinet, kan den variere fra timer til dager 18 år.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Freimann Life Science Center og Center for sebrafisk forskning personalet for deres stell og vedlikehold av sebrafisk.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 14095 | Any #5 tweezers with work |
Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments | Blade: 500314 Handle: 500317 |
|
Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton company | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 |
Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |