بناء هيدروجيل الكولاجين لتسليم الشيتوزان الجذعية المجهرية الخلية محملة
Summary
وهناك عقبة رئيسية في العلاج بالخلايا الجذعية الحالية هو تحديد الطريقة الأكثر فعالية لإيصال هذه الخلايا إلى أنسجة المضيف. هنا، نحن تصف طريقة تسليم الشيتوزان مقرها تتسم بالكفاءة والبساطة في الأسلوب، في الوقت الذي تسمح الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة للحفاظ على multipotency بهم.
Abstract
وقد تبين أن الخلايا الجذعية Multipotent أن تكون مفيدة للغاية في مجال الطب التجديدي 1-3. ومع ذلك، من اجل استخدام هذه الخلايا بشكل فعال من أجل تجديد الأنسجة، لا بد من اتخاذ عدد من المتغيرات في الاعتبار. هذه المتغيرات ما يلي: إجمالي حجم والمساحة السطحية للموقع غرس، والخواص الميكانيكية للأنسجة والأنسجة المكروية، والذي يتضمن كمية من الأوعية الدموية ومكونات المصفوفة خارج الخلية. ولذلك، يجب أن المواد المستخدمة لتقديم هذه الخلايا يكون حيويا مع التركيب الكيميائي المحددة مع الحفاظ على القوة الميكانيكية الذي يحاكي الأنسجة المضيف. ويجب أيضا أن تكون هذه المواد قابلة للاختراق على الأوكسجين والمواد المغذية لتوفير المكروية مواتية للخلايا لنعلق وتتكاثر. ويمكن الشيتوزان، وهو السكاريد الموجبة مع توافق مع الحياة ممتازة، وكيميائيا بسهولة تعديل ولها قابلية عالية للربط مع لجنة الهدنة العسكرية في الجسم الحيromolecules 4-5. الشيتوزان يحاكي جزء جلايكان من المصفوفة خارج الخلية، مما مكنها من العمل بوصفها ركيزة للهجرة الخلية، التصاق والانتشار. في هذه الدراسة نستخدم الشيتوزان في شكل المجهرية لتسليم الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من (ASC) في بناء الكولاجين ثلاثي الأبعاد سقالة 6. كان مصمما مثاليا الخلية إلى microsphere نسبة فيما يتعلق فترة حضانة وكثافة الخلية لتحقيق الحد الأقصى لعدد الخلايا التي يمكن تحميلها. مرة واحدة على المصنف ASC والمجهرية الشيتوزان (CSM)، التي هي جزء لا يتجزأ في سقالة الكولاجين ويمكن الحفاظ على الثقافة في لفترات طويلة. وخلاصة القول، فإن هذه الدراسة توفر طريقة لتقديم بالتحديد خلايا جذعية في غضون 3 سقالة بيولوجية الأبعاد.
Protocol
Discussion
وهناك عقبة رئيسية في العلاج بالخلايا الجذعية والقائم على تطوير أساليب فعالة لإيصال الخلايا إلى المناطق المحددة للإصلاح. نظرا لتقلب المريض إلى المريض، ونوع الأنسجة، وحجم الاصابة وعمق، ويجب أن تحدد منهجية للخلايا الجذعية تسليم على أساس كل حالة على حدة. على الرغم من ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم منطقة دبي للتعهيد عن طريق منحة من منح المؤسسة جنيف. كان مدعوما من قبل SN منحة زمالة ما بعد الدكتوراه في الهندسة من بيتسبرغ مبادرة الأنسجة.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
- Krampera, M. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair. Bone. 39, 678-683 (2006).
- Patrick, C. W. Tissue engineering strategies for adipose tissue repair. Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).
- Pountos, I., Giannoudis, P. V. Biology of mesenchymal stem cells. Injury. 36, S8-S12 (2005).
- Kim, I. Y. Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications. Biotechnol. Adv. 26, 1-21 (2008).
- Shi, C. Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine. J. Surg. Res. 133, 185-192 (2006).
- Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part. A. 16, 1369-1384 (2010).
- Bubnis, W. A., Ofner, C. M. The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
- Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 81, 259-268 (2007).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
- Shanmuganathan, S. Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery. Carbohydr. Polym. 73, 201-211 (2008).
- Haque, T., Chen, H., Ouyang, W., Martoni, C., Lawuyi, B., Urbanska, A., Prakash, S. Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate, chitosan, polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications. Int. J. Artif. Organs. 28, 631-637 (2005).
- Goren, A., Dahan, N., Goren, E., Baruch, L., Machluf, M. Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for long-term cellular therapy. FASEB J. 24, 22-31 (2010).
- Zielinski, B. A., Aebischer, P. Chitosan as a matrix for mammalian cell encapsulation. Biomaterials. 15, 1049-1056 (1994).
- Girandon, L., Kregar-Velikonja, N., Božikov, K., Barliç, A. In vitro Models for Adipose Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells Using Different Scaffolds of Natural Origin. Folia Biol. (Praha). 57, 47-56 (2011).
- Baruch, L., Machluf, M. Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on long-term viability. Biopolymers. 82, 570-579 (2006).
- Wei, Y., Gong, K., Zheng, Z., Wang, A., Ao, Q., Gong, Y., Zhang, X. Chitosan/silk fibroin-based tissue-engineered graft seeded with adipose-derived stem cells enhances nerve regeneration in a rat model. J. Mater. Sci. Mater. Med. , (2011).
- Wang, Q., Jamal, S., Detamore, M. S., Berkland, C. PLGA-chitosan/PLGA-alginate nanoparticle blends as biodegradable colloidal gels for seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 96, 520-527 (2011).
- Alves da Silva, M. L., Martins, A., Costa-Pinto, A. R., Correlo, V. M., Sol, P., Bhattacharya, M., Faria, S., Reis, R. L., Neves, N. M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2010).
- Kang, Y. M., Lee, B. N., Ko, J. H., Kim, G. H., Kang, K. N., Kim da, Y., Kim, J. H., Park, Y. H., Chun, H. J., Kim, C. H., Kim, M. S. In vivo biocompatibility study of electrospun chitosan microfiber for tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 11, 4140-4148 (2010).
- Bozkurt, G., Mothe, A. J., Zahir, T., Kim, H., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Chitosan channels containing spinal cord-derived stem/progenitor cells for repair of subacute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 67, 1733-1744 (2010).
- Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32, 57-64 (2011).
- Altman, A. M., Gupta, V., RÃos, C. N., Alt, E. U., Mathur, A. B. Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix. Acta Biomater. 6, 1388-1397 (2010).
- Altman, A. M., Yan, Y., Matthias, N., Bai, X., Rios, C., Mathur, A. B., Song, Y. H., Alt, E. U. IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model. Stem Cells. 27, 250-258 (2009).
- Machado, C. B., Ventura, J. M., Lemos, A. F., Ferreira, J. M., Leite, M. F., Goes, A. M. 3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomed. Mater. 2, 124-131 (2007).
