Assemblage in vitro de la semi-artificielle machine moléculaire et son utilisation pour la détection de lésions de l'ADN

Summary

Nous démontrons l'assemblage et l'application d'un dispositif à l'échelle moléculaire alimenté par une protéine topoisomérase. La construction est un capteur bio-moléculaires dont les étiquettes deux grands types de cassures de l'ADN dans les coupes de tissus en attachant deux fluorophores différents à leurs extrémités.

Abstract

Naturelle bio-moléculaire des machines de travail dans chaque cellule vivante et d'afficher une variété de modèles ^1-6. Pourtant, le développement de centres de machines moléculaires artificielles sur des appareils capables de mouvement directionnel, c'est à dire les moteurs moléculaires, et sur ​​leur échelle réduite des pièces mécaniques (roues, essieux, etc pendentifs) ^7-9. Cette imite les machines macro-, même si les propriétés physiques essentielles pour ces appareils, tels que l'inertie et la conservation du moment, ne sont pas utilisables dans les environnements nanomonde ^10. Conceptions alternatives, qui ne suivent pas les schémas mécaniques macromachines et utiliser des mécanismes développés dans l'évolution des molécules biologiques, peuvent profiter des conditions spécifiques du nanomonde. Par ailleurs, l'adaptation réelle des molécules biologiques aux fins de la nano-conception permet de réduire les dangers potentiels des produits des nanotechnologies peuvent présenter. Ici nous démontrons l'assemblage et l'application d'une telle bio-permis de construire, commeemi-artificiel appareil moléculaire, qui associe une machine naturelle moléculaire avec des composants artificiels. Du point de vue de l'enzymologie, notre construction est un concepteur fluorescents complexes enzyme-substrat mis ensemble pour remplir une fonction spécifique utile. Cet ensemble est par définition une machine moléculaire, car il contient un ^12. Pourtant, son intégration avec la partie ingénierie – fluorescentes épingle double – le re-dirige vers une nouvelle tâche d'étiquetage ¹² dommages à l'ADN.

Notre construire assemble d'un ADN de 32-mer et d'une enzyme topoisomérase I vaccine (VACC TOPO). La machine utilise alors son propre matériel pour fabriquer deux unités de détection marqués par fluorescence (figure 1). L'une des unités (fluorescence verte) effectue VACC TOPO covalente à son extrémité 3 'et une autre unité (fluorescence rouge) est une épingle à cheveux libres avec un 3'OH terminal. Les unités sont de courte durée et rapidement montés de nouveau dans la construction d'origine, qui recleaves ultérieurement.En l'absence d'ADN pauses ces deux unités séparées en continu et religate de façon cyclique. Dans des coupes de tissus avec des dommages à l'ADN, l'unité de détecteur de topoisomérase porteurs attache sélective aux cassures de l'ADN à bouts francs avec 5'OH (DNase II de type casse) ^11,12, fluorescence leur étiquetage. La seconde, sans enzyme épingle formé après clivage oligonucléotidique, sera ligaturer à un 5'PO ₄ à extrémité franche rupture (DNase I type pauses) ^11,12, si l'ADN ligase T4 est présent dans la solution ^13,14. Lorsque l'ADN ligase T4 est ajouté à une coupe de tissu ou d'une solution contenant de l'ADN avec des 5'PO ₄ bouts francs pauses, la ligase réagit avec 5'PO ₄ extrémités d'ADN, formant semi-stable enzyme-ADN. Les épingles à bouts francs vont interagir avec ces complexes libérant épingles ligase et lier de façon covalente à l'ADN, ce qui étiquetage 5'PO ₄ cassures de l'ADN à bouts francs.

Ce développement illustre une nouvelle approche pratique pour ela conception électronique de machines moléculaires et offre un capteur utile pour la détection de l'apoptose et endommagent l'ADN dans les cellules et les tissus fixes.

Protocol

Les sections de la machine moléculaire basé sur la détection devrait être préparée d'abord parce que leur préparation prend plus de temps que le montage du dispositif moléculaire. La construction fonctionne bien avec le 5-6 microns d'épaisseur pans coupés du paraformaldéhyde-fixes, des blocs de tissus inclus en paraffine. Utiliser les marques diapositives qui conservent des sections bien, comme ProbeOn plus diapositives chargées et préalablement nettoyées (Fisher Scientific) ou similaire. Nous reco…

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons comment assembler et à utiliser un capteur à double marquage de l'ADN des dommages. Le capteur est une machine moléculaire tirée par la bio-moléculaires moteur, un virus protéine codée VACC TOPO liés à des composants artificiels. Le développement a présenté illustre une approche bio-permis qui prône l'adaptation des structures biologiques, des architectures et des pièces réelles et des composants de cellules à la conception des dispositifs de non-toxique à l&#…

Materials

1. Xylene
2. 80 and 96% Ethanol.
3. 2% solution of bovine serum albumin (BSA) in distilled water.
4. Oligonucleotide 1: a double-hairpin, dual labeled with fluorescein and tetramethylrhodamine:

5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT RAT GCG TT- 3′; F – FITC-dT; R – Tetramethylrhodamine-dT. Other red-shifted fluorophores such as BODIPY TR, rhodamine or TAMRA can be used instead of tetramethylrhodamine as R.

Alternatively you can use Oligonucleotide 2 – a double-hairpin single labeled with fluorescein (for detection of a single type of DNA breaks (DNase II-type only). The single-fluorophore-carrying probe is considerably less expensive and is convenient whenever a single type of DNA break is to be labeled: 5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3′; F – FITC-dT

5. Oligonucleotide 3. Blunt-ended rhodamine-labeled hairpin for enhancement of in situ ligation signal with T4 DNA ligase: 5′-GCG CTA GAC CRG GTC TAG CGC-3′; R – Tetramethylrhodamine-dT
6. Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC TOPO) – 3000 U/μL (Vivid Technologies). In the initial experiments we used 215 pmoles (7.1 μg) of the VACC TOPO per every 25 μL of the reaction mix. However, the topoisomerase concentration can be significantly reduced without the loss of sensitivity. We later used a four times lesser amount of VACC TOPO per section (1.76 μg in 25 μL of the reaction mix per section) with similar results. Reducing amount of the enzyme to 880 ng (in 25 μL of the reaction mix) resulted in a weaker signal and 8.8 ng of VACC TOPO produced no detectable signal.
7. T4 DNA ligase 5 U/μL (Roche). This highly concentrated ligase preparation gives the best signal in our experimental conditions.
8. 10 x reaction buffer for T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20° C) (Roche) . ATP in reaction buffer is easily destroyed in repetitive cycles of thawing-freezing. Aliquot the buffer in small 15-20 μL portions and store at – 20° C. Use once.
9. 30% (w/v) solution of PEG-8000 (Sigma) in bidistilled water. 15 % PEG-8000 in the reaction mix strongly stimulates the detection, increasing the effective concentrations of its constituents by volume exclusion.
10. Proteinase K (Roche) 20 mg/mL stock solution in distilled water. Store at – 20° C. In the reaction use 50mg/mL solution in PBS, prepared from the stock. Do not reuse.
11. Vectashield with DAPI (Vector Laboratories).
12. Sodium bicarbonate buffer: 50mM NaHCO₃, 15mM NaCl, pH 8.2.
13. 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.