In vitro Montering av Semi-kunstig Molecular Machine og dens bruk for påvisning av DNA Damage

Summary

Vi viser montering og anvendelse av en molekylær skala enhet drevet av en topoisomerase protein. Den konstruere er en bio-molekylær sensor hvilke etiketter to hovedtyper av DNA brudd i vev seksjoner ved å feste to forskjellige fluorophores til sine formål.

Abstract

Naturlig forekommende bio-molekylære maskiner arbeid i hver levende celle og vise en rekke design ^1-6. Men utviklingen av kunstige molekylære maskiner sentre på enheter i stand til retningsbestemt bevegelse, dvs. molekylære motorer, og på deres nedskalert mekaniske deler (hjul, aksler, smykker etc) ^7-9. Dette imiterer makro-maskiner, selv om de fysiske egenskapene avgjørende for disse enhetene, som treghet og momentum bevaring, er ikke brukbare i nanoworld miljøer ^10. Alternative designs, som ikke følger mekaniske macromachines ordninger og bruk mekanismer utviklet i evolusjonen av biologiske molekyler, kan dra nytte av de konkrete forholdene i nanoworld. Dessuten tilpasser faktiske biologiske molekyler i forbindelse med nano-design reduserer potensielle farer nanoteknologi produktene kan utgjøre. Her kan vi demonstrere montering og anvendelse av en slik bio-aktivert konstruere, somEMI-kunstig molekylær enhet som kombinerer en naturlig forekommende molekylær maskin med kunstig komponenter. Fra enzymologi synspunkt, er vår konstruere en designer fluorescerende enzym-substrat kompleks satt sammen for å utføre en bestemt nyttig funksjon. Denne forsamlingen er per definisjon en molekylær maskin, da det inneholder en ^12. Likevel, dets integrasjon med konstruerte delen – dirigerer re-den til en ny oppgave merking DNA-skader ¹² – fluorescerende dual hårnål.

Våre konstruere samler ut av en 32-mer DNA og enzymet vaccinia topoisomerase I (Vacc topo). Maskinen bruker deretter sitt eget materiale for å dikte to fluorescensmerkede detektor enheter (figur 1). En av enhetene (grønn fluorescens) bærer Vacc Topo kovalent festet til sin 3'end og en annen enhet (rød fluorescens) er et gratis hårnål med en terminal 3'OH. Enhetene er kortvarige og raskt montere tilbake til den opprinnelige konstruere, som senere recleaves.I fravær av DNA bryter disse to enhetene fortløpende separate og religate i en syklisk måte. I vev seksjoner med DNA-skade, topoisomerase-bærer detektor enhet selektivt festes til stump-ended DNA bryter med 5'OH (DNase II-type pauser) ^11,12, fluorescensmerket merking dem. Den andre, enzym-free hårnål dannet etter oligonukleotid cleavage, vil ligate til en 5'PO ₄ stump-ended pause (DNase I-typen pauser) ^11,12, hvis T4 DNA ligase er til stede i løsningen ^13,14. Når T4 DNA ligase er lagt til en vev avsnitt eller en løsning som inneholder DNA med 5'PO ₄ sløv-ended pauser, reagerer ligase med 5'PO _fire DNA ender, forming semi-stabile enzym-DNA komplekser. Den butte endte hårnåler vil samhandle med disse kompleksene frigjøre ligase og kovalent linking hårnåler til DNA, og dermed merking 5'PO ₄ stump-endte DNA pauser.

Denne utviklingen eksemplifiserer en ny praktisk tilnærming til the utforming av molekylære maskiner og gir en nyttig sensor for deteksjon av apoptose, og DNA-skader i faste celler og vev.

Protocol

Delene for molekylær maskin-basert gjenkjenning bør være forberedt første fordi deres forberedelser tar mer tid enn montering av molekylære enheten. Den konstruerer fungerer godt med 5-6μm tykke seksjoner kuttet fra Paraformaldehyde-fast, parafin-embedded tissue blokker. Bruk skyv merker som beholder deler godt, slik som ProbeOn Plus ladet og precleaned lysbilder (Fisher Scientific) eller lignende. Vi anbefaler å først bruke en vev med et velkjent mønster av DNA-skade som inneholder både DNase I-og DNase II-ty…

Discussion

I denne videoen viser vi hvordan å sette sammen og bruke en dual-merking DNA skade sensor. Sensoren er en molekylær maskin drevet av bio-molekylær-motoren, en virus-kodet protein Vacc Topo forbundet med kunstige komponenter. Den presenterte utviklingen eksemplifiserer en bio-aktivert tilnærming som talsmenn tilpasse biologiske strukturer, arkitekturer og faktiske deler og komponenter av celler til utforming av ikke-giftig molekylær skala enheter ^12,15. Denne tilnærmingen løser to problemer som ligger t…

Materials

1. Xylene
2. 80 and 96% Ethanol.
3. 2% solution of bovine serum albumin (BSA) in distilled water.
4. Oligonucleotide 1: a double-hairpin, dual labeled with fluorescein and tetramethylrhodamine:

5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT RAT GCG TT- 3′; F – FITC-dT; R – Tetramethylrhodamine-dT. Other red-shifted fluorophores such as BODIPY TR, rhodamine or TAMRA can be used instead of tetramethylrhodamine as R.

Alternatively you can use Oligonucleotide 2 – a double-hairpin single labeled with fluorescein (for detection of a single type of DNA breaks (DNase II-type only). The single-fluorophore-carrying probe is considerably less expensive and is convenient whenever a single type of DNA break is to be labeled: 5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3′; F – FITC-dT

5. Oligonucleotide 3. Blunt-ended rhodamine-labeled hairpin for enhancement of in situ ligation signal with T4 DNA ligase: 5′-GCG CTA GAC CRG GTC TAG CGC-3′; R – Tetramethylrhodamine-dT
6. Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC TOPO) – 3000 U/μL (Vivid Technologies). In the initial experiments we used 215 pmoles (7.1 μg) of the VACC TOPO per every 25 μL of the reaction mix. However, the topoisomerase concentration can be significantly reduced without the loss of sensitivity. We later used a four times lesser amount of VACC TOPO per section (1.76 μg in 25 μL of the reaction mix per section) with similar results. Reducing amount of the enzyme to 880 ng (in 25 μL of the reaction mix) resulted in a weaker signal and 8.8 ng of VACC TOPO produced no detectable signal.
7. T4 DNA ligase 5 U/μL (Roche). This highly concentrated ligase preparation gives the best signal in our experimental conditions.
8. 10 x reaction buffer for T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20° C) (Roche) . ATP in reaction buffer is easily destroyed in repetitive cycles of thawing-freezing. Aliquot the buffer in small 15-20 μL portions and store at – 20° C. Use once.
9. 30% (w/v) solution of PEG-8000 (Sigma) in bidistilled water. 15 % PEG-8000 in the reaction mix strongly stimulates the detection, increasing the effective concentrations of its constituents by volume exclusion.
10. Proteinase K (Roche) 20 mg/mL stock solution in distilled water. Store at – 20° C. In the reaction use 50mg/mL solution in PBS, prepared from the stock. Do not reuse.
11. Vectashield with DAPI (Vector Laboratories).
12. Sodium bicarbonate buffer: 50mM NaHCO₃, 15mM NaCl, pH 8.2.
13. 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.