Выделение и расширения человеческих клеток глиобластомы мозга Опухоль Использование Neurosphere Пробирной

Summary

Это видео демонстрирует протокол изоляции и расширения стволовые клетки, как из хирургически удаленных человеческих mutliforme глиобластомы (GBM) опухолевой ткани использованием метода культуры neurosphere анализа.

Abstract

Стволовые-подобных клеток были выделены в опухолей, таких как рак молочной железы, легких, толстой кишки, предстательной железы и мозга. Важным вопросом во всех этих опухолей, особенно в глиобластомы mutliforme (GBM), заключается в выявлении и изоляции опухоль начала клеточной популяции (ы), чтобы исследовать их роль в образовании опухоли, прогрессирование и повторения. Понимание опухоль начала клеточных популяций предоставят ключи к поиску эффективных терапевтических подходов для этих опухолей. Neurosphere анализа (NSA), благодаря своей простоте и воспроизводимости была использована в качестве метода выбора для изоляции и распространения многих из этого опухолевые клетки. Этот протокол демонстрирует neurosphere метод культуры, чтобы изолировать и расширить стволовых клеток, как хирургически удаленных человеческих тканей опухоли GBM. Процедуры включают в себя начальное переваривание химической и механической диссоциации опухолевой ткани, а затем покрытие в результате суспензии отдельных клеток в культуре АНБ. Через 7-10 дней, первичные нейросферы из 150-200 мкм в диаметре может наблюдаться и готовы к дальнейшему пассажей и расширения.

Protocol

1. Сбор первичных тканей GBM Глиобластомы mutliforme (GBM) опухоли получается из пациентов с диагнозом рак и перенесших операцию. Меры должны быть сделаны с нейрохирургия команда. Нейрохирург будет место удаленной опухоли GBM в соответствующий размер трубы содержащие нейронных стволовых клеток (НСК) базальной среде, дополненной 10-15% антибиотиков (Peniciline / стрептомицин). Холодная среда должна быть предоставлена ​​операционной комнате лаборатории. Кроме того, холодные HEPES буфером минимальной необходимой среде (ВЭМ) или фосфатно-солевым буфером (PBS) с высокой концентрацией антибиотиков также может быть использован для этой цели. Ткани резекции опухоли доставляется в лабораторию на льду и под капотом. 2. Диссоциация первичной опухоли в монопольном клеточной суспензии Превышение первоначальной среды / PBS будет удален из трубки сокола и образец промывают 2-3 раза с 5-10мл PBS / НСК базальной среды для удаления крови и мусора. PBS / Средний удаляется и GBM опухолевой ткани помещают в чашку Петри. Ткань разрезают на мелкие кусочки и фарш с № 10 лезвие скальпеля на мелкие кусочки, чтобы увеличить площадь поверхности для трипсинизации процесса. Измельчения может занять 1-3 минут в зависимости от размера опухоли. Фарш ткани трипсином в 3-5 мл подогретого 0,05% трипсина-EDTA в течение 10-15 минут при температуре 37 ° С водяной бане. Электронная пипетка используется для передачи мелкие кусочки опухоли и трипсина в 15 мл трубки Falcon. Равный объем соевого ингибитора трипсина добавляется, чтобы остановить ферментативной реакции трипсин после инкубационного периода. Трипсин инактивации обеспечивается с помощью пипетки подвески вверх и вниз несколько раз. Затем, подвеска гранулированный вниз центрифугированием при 800rpm (110г) за 5 мин. Супернатант отбрасывается и ткани куски ресуспендировали в 1 мл стерильной НСК басал среды. Скопления разобщены, осторожно пипеткой вверх и вниз (3-7 раз), пока гладкие молочно суспензии отдельных клеток достигается. Число шагов пипетирования напрямую зависит от размера частиц в измельченной ткани. Длительные и энергичной механической диссоциации следует избегать, поскольку это может привести к гибели клетки и сокращения в сфере образования. Чтобы удалить не-диссоциированных частей и обломков, 10-15 мл базальной среды добавляется к трубе и клеточная суспензия фильтруется через сетчатый фильтр 40 микрон ячейка в 50 мл трубки. Фильтруется суспензию центрифугируют при 800rpm (110г) за 5 мин. Супернатант отбрасывается после этого. Pelletted клетки затем ресуспендировали в 1-2 мл полной среды ННЦ для подсчета клеток. 3. Клеток и покрытие 10 мкл клеточной суспензии добавляют 90 мкл 0,04% Трипановый синего в 1 мл пробирку Эппендорфа. Примечание: другие соответствующую ячейку dilutions также может быть использован. Внесите вверх и вниз, смешать подвески. 10 мкл клеток / трипанового синего смесь передается гемоцитометра того, чтобы считать плотность клеток. Клетки высевают в полной среде NSC (смесь НСК базальной среды и СНБ распространения дополнения в 9:01 отношения) с добавлением 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF и 1μl/ml 0,2% гепарина (2μg/ml) в соответствующего суда культуры ткани. 5, 20 и 40 мл среды используется для T25, T80 и T175 колбы, соответственно. Антибиотики могут быть добавлены к среде при концентрации 1:100 уменьшить шанс заражения. Колбу помещают в термостат при температуре 37 ° С и 5% CO 2. 4. Пассажей и расширение GBM производные сферах: Когда нейросферы достигли среднего размера 150-200 мкм в диаметре, культура готов к субкультуре. Содержание каждой колбе демонтирован и помещен в соответствующий размер стерильных Tissу.е. в пробирку и центрифугируют при 800 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин при комнатной температуре. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 1 мл 0,05% трипсина-EDTA. Для достижения оптимального трипсинизации, клеточную суспензию инкубировали при 37 ° С на водяной бане в течение 2-3 мин. Чтобы остановить трипсина деятельности равный объем соевого ингибитора трипсина добавляется к клеточной суспензии и суспензии клеток осторожно пипеткой вверх и вниз. Клеточной суспензии центрифугируют при 800 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин. Затем супернатант удаляли, а клетки ресуспендируют в 1 мл среды НСК. Подсчет клеток проводили, как описано ранее. Клетки высевали в концентрации 5×10 4 клеток / мл в полной среде НСК дополнены факторы роста и помещают в соответствующего размера культуре ткани судов, как описано в предыдущей части. Вторичные нейросферы формируются через 7-10 дней, когда инкубировали при 37 ° C во влажнойified инкубаторе с 5% CO 2. 5. Представитель Результаты: После покрытия одной клеток, полученных из тканей опухоли GBM, опухолевые стволовые клетки размножаются, как и создавать небольшие скопления клеток состоят из нескольких клеток в течение 3-4 дней (см. видео и рисунок 1). Так как эти кластеры растут, они приобретают более сферическую форму, так что на 7-8 дней, правильное фазы яркие шары с средним диаметром 150-200 микрон формы (см. видео и рисунок 2). При большем увеличении, здоровой сферы обычно демонстрируют microspikes на их периферии. Имея большой сферы, как кластеры в течение 1-2 дней после начала культура происходит из-за существования не-диссоциированных сгустки в разбрасывать деньги налево культуры и не следует путать с истинным сферах. Количество мусора в первичной опухоли сфере культуры меняется в зависимости от исходного источника тканей и является ли оно включает в себя любые окружающие ткани мозга. Правильное методы подготовки тканив том числе ферментативных и механической диссоциации и последующей фильтрации образца с достаточным количеством среды может привести к снижению мусора в культуре. Рисунок 1. Первичные сфере культуры GBM через 4 дня после покрытия. Опухолевые стволовые клетки размножаются, как и создавать небольшие скопления клеток в 3-4 дня. Оригинальные Увеличение; 20x. Рисунок 2. Прохождение один GBM сфере культуры через 8 дней после металлизации. Оригинальные Увеличение; 20x.

Discussion

Чтобы изолировать нейронных стволовых и прогениторных клеток из нормальных взрослых и плода мозг ^{1, 2, 3, 4,} а также опухолевые стволовые клетки, как от рака тканей, таких как рак легких ^{5, 6} простаты, молочной железы ⁷ и ^{8 мозг, 9} neurosphere анализа была часто используется как метод выбора. С помощью этой простой и воспроизводимый анализ, можно генерировать неограниченное число клеток из ткани удаленной опухоли, которые показывают, что аналогичные характеристики, как соматические стволовые клетки, экс multipotency живом организме, способность создавать новые опухоли при имплантации, и самообновлению. Эти клетки могут быть использованы для изучения фундаментальной биологии раковых клеток, включая клетки к межклеточных взаимодействий и дифференциации, миграции, вторжения и гибели клеток. Кроме того, изолированные опухолевые стволовые клетки обеспечивают как бесценным инструментом для изучения того, как опухоль формы, прогресс, и рецидивов, а также раскрыть основные вытекающие клеточные механизмы, которые в конечном итоге может дать ответ на терапевтическиеварианты.

Materials

Name of the reagent	Type	Company	Catalogue number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium (Human)	Medium	Stem Cell Technologies	05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human)	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05753
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	Gibco	25300-062
*MEM	Reagent	Gibco	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	Gibco	15230-147
**DNase I	Reagent	Roche	104159
**Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma	T6522
Pen/Strep	Reagent	Gibco	15140-122
No. 10 scalpel blade	Surgical tool	BD	371610
Petri Dish	Culture ware	BD Falcon	353003
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050-10
Cell strainer	Sieve	BD Falcon	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352070
EGF	Growth factor	R&D	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma	H4784	Reconstituted in PBS

* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.