El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos
Summary
Se presenta un protocolo que permite ver y para evaluar cuantitativamente la morfología del árbol dendrítico de las células de Purkinje individuales cultivadas en cultivos de cortes organotípicos cerebelosos. Este protocolo tiene como objetivo promover estudios sobre los mecanismos de desarrollo de Purkinje células dendríticas.
Abstract
Células de Purkinje son un sistema de modelo atractivo para el estudio de desarrollo dendrítico, porque tienen un árbol dendrítico impresionante que es estrictamente orientada en el plano sagital y se desarrolla principalmente en el periodo postnatal en roedores pequeños 3. Además, los anticuerpos se encuentran disponibles varios que selectivamente y de forma intensiva marcar células de Purkinje, incluyendo todos los procesos, con anti-Calbindin D28K siendo el más ampliamente utilizado. Para la visualización de las dendritas en las células vivas, los ratones que expresan EGFP selectivamente en las células de Purkinje 11 están disponibles a través de los laboratorios Jackson. Organotípicos culturas cerebelosos rebanada células permiten una fácil manipulación experimental de desarrollo Purkinje células dendríticas porque la mayor parte de la expansión dendríticas del árbol dendrítico de células de Purkinje que de hecho ocurre durante el período de cultivo 4. Presentamos aquí un protocolo corto, fiable y fácil para la visualización y el análisis de la morfología dendrítica de las células de Purkinje crecido en organotypic cultivos de cortes cerebelosos. Para muchos fines, una evaluación cuantitativa del árbol dendrítico de células de Purkinje es deseable. Nos centramos aquí en dos parámetros, tamaño del árbol dendrítico y los números de punto de ramificación, que puede ser rápidamente y fácilmente determinadas a partir de anti-calbindina cultivos teñidos rebanada cerebelosos. Estos dos parámetros obtener una medida fiable y sensible de los cambios del árbol de células dendríticas Purkinje. Usando el ejemplo de los tratamientos con la proteína quinasa C PMA (PKC) y el activador del receptor de glutamato metabotrópico 1 (mGluR1) se demuestra cómo las diferencias en el desarrollo dendrítico se visualizan y evaluó cuantitativamente. La combinación de la presencia de un árbol dendrítico extensa, los métodos selectivos y de inmunotinción intensa, cultivos organotípicos rebanada que cubren el período de crecimiento dendrítico y un modelo de ratón con expresión de células de Purkinje EGFP específico hacer las células de Purkinje un sistema modelo de gran alcance para revelar los mecanismos de la dendríticas desarrollo.
Protocol
Discussion
Los métodos aquí presentados permiten estudiar el desarrollo de células de Purkinje dendríticas en cultivos de cortes organotípicos cerebelares y para evaluar cuantitativamente la expansión Purkinje de células dendríticas mediante la medición de tamaño de árbol dendrítico y el número de puntos de ramificación dendríticas. Por supuesto, un análisis cuantitativo más amplio y sofisticado de las dendritas de células de Purkinje es posible, por ejemplo, determinando la longitud dendrítica total, realizando…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Universidad de Basilea, del Departamento de Biomedicina, y la Swiss National Science Foundation (31003A-116624).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
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