から細胞外液のヴァンパイア·アイソレーション<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em
Summary
モデル生物<em> Cエレガンス</em>受動循環系としてpseudocoelomic流体を使用しています。この流体の直接アッセイは、以前には不可能であった。ここでは、直接アッセイするために、細胞外空間を斬新な手法を提示し、原則として例の証拠としてRNAi応答時に全身のサイレン信号を使用する。
Abstract
遺伝的に扱いやすいモデル生物で虫はその短い世代時間で有効になって生物学的な質問でも、成長と小型のしやすさの無数の洞察を提供してきました。この小さなサイズは、しかし、他のモデルシステムに見られる技術的なアプローチの数を不許可しています。たとえば、哺乳動物系と植物の接ぎ木技術の輸血は、循環系の組成およびシグナリングの質問を有効にします。ワームの循環系、偽体腔は、最近まで直接アッセイすることは不可能であった。細胞間のシグナリングおよび循環器系の組成物Cの質問にお答えするには虫の研究者は、伝統的に遺伝的解析、細胞/組織特異救助、及びモザイク解析に目を向けました。これらの技術は、細胞間で何が起こっているのかを推測するための手段を提供しますが、細胞外分子の同定および特徴に普遍的に適用されません。ここでは、NEを提示直接アッセイするwly開発された技術でのpseudocoelomic流体エレガンス 。技術は細胞外液の量を増加させるためにいずれかの遺伝的または物理的操作から始まります。その後動物は細かいバランス圧力制御を可能にするマイクロインジェクションのリグを使用して吸血鬼の逆マイクロインジェクション法に供される。細胞外液の分離した後、収集された流体は、他の動物への伝達によってまたは分子によってアッセイすることができる。この手法の有効性を実証するために、我々は全身RNAi応答時のアッセイ細胞外シグナル伝達分子、長いdsRNAの具体例を詳細にアプローチを提示する。全身性RNAiの特性評価は、原則として例の証拠ですが、私たちは、循環系の組成およびシグナリングのさまざまな質問に答えるために適応可能であるとして、このテクニックを参照してください。
Protocol
Discussion
我々はここで、モデル生物Cから細胞外液の単離および特徴付けを可能にする新規な方法を提示しているエレガンス 。技術は細胞外液の合計量を高めるためにドナーワームの遺伝的または物理的操作から始まります。細胞外液は、その後、変更されたマイクロインジェクション法を用いて単離される。ワームは、手順の間に依然としてワームを保持するために、乾燥したアガロ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はハンターラボの共同性質を承諾したがって、この技術の開発が可能とからかわ役立つ議論と支援のためにそれらに感謝します。我々はナイジェルデラニーやワーム、および細菌株に対する線虫Caenorhabditis遺伝学センターに感謝したいと思います。この作品は、米国国立衛生研究所CPHにGM089795助成金によって支えられている。
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
