Preparación de la muestra de<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Extractos de Estudios de Resonancia Magnética Nuclear metabolómica
Summary
El perfil de metabolómica<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Se determina después de crecimiento en cultivos de caldo. Las condiciones se pueden variar para probar los efectos de los suplementos nutricionales, agentes oxidantes, y agentes contra la tuberculosis en el perfil metabólico de este microorganismo. Procedimiento para la preparación del extracto es aplicable tanto para 1D<sup> 1</sup> H y 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> C análisis de RMN.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis es la principal causa de mortalidad en los seres humanos a escala mundial. La aparición de ambos múltiples (MDR) y ampliamente-(XDR) de las cepas resistentes a los medicamentos amenaza con descarrilar los esfuerzos actuales de control de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar fármacos y vacunas que son más eficaces que los disponibles actualmente. El genoma de M. tuberculosis se conoce desde hace más de 10 años, sin embargo hay importantes lagunas en nuestro conocimiento de la función de los genes y la esencialidad. Muchos estudios han utilizado desde entonces el análisis de la expresión génica a nivel transcriptomic y proteómicos para determinar los efectos de las drogas, oxidantes, y las condiciones de crecimiento en los patrones globales de expresión génica. En última instancia, la respuesta final de estos cambios se refleja en la composición metabólico de la bacteria incluyendo unos pocos miles de productos químicos de bajo peso molecular. Comparando los perfiles metabólicos de tipo salvaje y cepas mutantes, o bien no tratados o treated con un fármaco particular, puede efectivamente permitir la identificación del blanco y puede conducir al desarrollo de nuevos inhibidores con actividad antituberculosa. Del mismo modo, los efectos de dos o más condiciones en el metaboloma también se puede evaluar. Resonancia magnética nuclear (RMN) es una poderosa tecnología que se utiliza para identificar y cuantificar los intermediarios metabólicos. En este protocolo, los procedimientos para la preparación de M. extractos celulares tuberculosis para análisis de RMN se describen metabolómico. Los cultivos de células se cultivan en condiciones apropiadas y contención requerido nivel de bioseguridad 3, 1 recolectadas, y se sometieron a lisis mecánica, manteniendo las temperaturas frías para maximizar la conservación de los metabolitos. Los lisados celulares se recuperó, se filtró esterilizada, y se almacena a temperaturas ultra-bajas. Partes alícuotas de estos extractos celulares se sembraron en agar Middlebrook 7H9 para unidades formadoras de colonias para verificar la ausencia de células viables. Tras dos meses de incubación a 37 ° C, si no vicolonias capaces se observan, las muestras se retiran de la instalación de contención para el procesamiento aguas abajo. Los extractos se liofilizaron, se resuspendieron en tampón deuterado y se inyectó en el instrumento de RMN, la captura de los datos espectroscópicos que se somete después a análisis estadístico. Los procedimientos descritos se pueden aplicar por tanto de una dimensión (1D) de RMN 1 H y de dos dimensiones (2D) 1 H-13 C análisis de RMN. Esta metodología proporciona más fiable identificación de pequeño peso molecular metabolito y análisis cuantitativos más fiables y sensibles de las composiciones de extracto de células metabólicas que los métodos cromatográficos. Las variaciones del procedimiento descrito después de la etapa de lisis celular también se puede adaptar para el análisis proteómico paralelo.
Protocol
Discussion
Un gran número de estudios han analizado los perfiles transcriptomic y proteómicos de M. tuberculosis bajo una variedad de ensayos in vitro e in vivo. 11-16 En última instancia, los cambios en la expresión génica y la actividad enzimática conducen a variaciones en las concentraciones de las pequeñas moléculas de peso molecular. La descripción completa de estos compuestos constituye el metaboloma. Por lo tanto, los efectos de las drogas y las diferentes condiciones …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a todos los miembros de los laboratorios del Dr. Barletta y Powers Dr. útiles comentarios durante el desarrollo del protocolo. Damos las gracias a Wendy Austin útil para los debates y correcciones del manuscrito. El trabajo que se describe en este manuscrito fue financiado por becas piloto de semillas para cada investigador mencionado anteriormente de la Universidad de Nebraska-Lincoln Center Biología redox (padre subvención # 017675 2P20RR CNRR, D. Becker, PI). Además, agradecemos a la Dra. Ofelia Chacón para el suministro de fondos de la subvención R21 (1R21AI087561-01A1) para suministros de investigación y de apoyo a sueldo parcial Sr. Halouska para estandarizar técnicas de RMN incluyen en esta publicación.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| ADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| BACS-120 Sample Changer | Bruker | ||
| Bruker Avance NMR | Bruker | 500 MHz | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Fraction V |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | Benchtop |
| Centrifuge Tubes | Corning | 430291 | 50 ml sterile polypropylene |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | 2.0 ml sterile polypropylene |
| Cycloheximide | A.G. Scientific | C-1189 | Toxic |
| D(+) – Glucose | ACROS | 41095-0010 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385 | |
| Erlenmeyer Flask | VWR | 89095-266 | Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap |
| Flash Freeze Flask | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| Freeze Dryer | VWR | 82019-038 | 4.5 L Benchtop |
| Glycerol | GibcoBRL | 15514-029 | |
| Incubator | New Brunswick | Innova 40 | Benchtop shaker |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911-100 | |
| Lysis Machine | MP Biomedicals | FastPrep-24 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | Benchtop |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | Benchtop |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco | 271310 | |
| NMR tubes | Norell | ST500-7 | 5mM |
| OADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| Oleic Acid | Sigma | O1008 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR | BDH0266 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | BDH0268 | |
| Rotor – Microfuge 22R | Beckman Coulter | F241.5P | Sealed and polypropylene |
| Rotor – Allegra X-15R | Beckman Coulter | SX4750 | With bio-certified covers |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 | Cambridge Isotope | DLM-48 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU-530 | |
| Spectrophotometer Cuvettes | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides |
| Syringe | Becton Dickinson | 309585 | Sterile, 3 ml Luer-Lok |
| Syringe Filter | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm sterile cellulose acetate |
| Tween 80 | Fisher Scientific | BP338-500 |
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