Detecção de translocação Toxina no Citosol host por ressonância plasmon de superfície

Summary

Neste relatório, nós descrevemos como ressonância de plasma de superfície é usado para detectar a entrada de toxinas para o citosol host. Este método altamente sensível pode fornecer dados quantitativos sobre a quantidade de toxina citosólica, e pode ser aplicado a uma variedade de toxinas.

Abstract

Toxinas AB consistem de uma subunidade enzimática A e uma célula de ligação da subunidade B ^1. Estas toxinas são secretadas para o meio extracelular, mas agir de acordo com as metas dentro do citosol eucarióticas. Algumas viagens AB toxinas pelas transportadoras vesícula da superfície da célula para o retículo endoplasmático (ER) antes de entrar no citosol ^2-4. Na ER, o dissocia catalítico Uma cadeia do resto da toxina e se move através de um canal condutor de proteína para atingir o seu objectivo citosólica ^5. O translocados, a cadeia A citosólica é difícil de detectar porque o tráfico de toxinas para o ER é um processo extremamente ineficiente: a toxina mais internalizado é encaminhado para a lisossomos para degradação, portanto, apenas uma pequena fração da superfície-bound toxina atinge o aparelho de Golgi e ER ^{6 -12.}

Para monitorar a translocação da toxina da ER para o citosol em cultura de células, nós combinamos um protocolo de fracionamento subcelular com o highly método de detecção sensível de ressonância plasmon de superfície (SPR) ^13-15. A membrana plasmática das células tratadas com a toxina é seletivamente permeabilizadas com digitonina, permitindo cobrança de uma fração citosólica que posteriormente é perfundido durante um sensor de SPR revestido com uma toxina anti-Um anticorpo cadeia. O sensor de anticorpos revestido pode capturar e detectar pg / mL quantidades de toxina citosólica. Com este protocolo, é possível acompanhar a cinética de entrada de toxinas para o citosol e caracterizar efeitos inibitórios sobre o evento de translocação. A concentração de toxina citosólica também pode ser calculado a partir de uma curva padrão gerada com quantidades conhecidas de A cadeia de padrões que foram perfundidos sobre o sensor. Nosso método representa uma resposta rápida, sensível sistema de detecção e quantitativas que não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina alvo.

Protocol

1. Preparação de digitonina Adicionar 500 mL de etanol a 100% para um tubo de microcentrífuga e colocá-lo em um bloco de aquecimento fixado em 80 ° C por 10 min. Dissolver 2,5 mg de digitonina em 250 mL de etanol aquecido para produzir uma solução estoque de 1% do digitonina. Para gerar uma solução de trabalho de digitonina 0,04%, adicionar 40 mL da solução estoque para 960 mL digitonina de HCN tampão (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-etilmaleimi…

Discussion

Comparação com a metodologia existente

Nosso ensaio translocação SPR baseado representa um método rápido, sensível, e quantitativa para detectar entrega toxina no citosol host. A técnica não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina, e pode ser aplicado a qualquer toxina para o qual um anti-toxina Um anticorpo cadeia está disponível. Métodos existentes para monitorar a passagem de toxinas para o citosol também dependem de um protocolo de fracionamento subcel…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Digitonin	Sigma	D141
Ethanol	Acros	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
Ganglioside GM1	Sigma	G7641
CTA	Sigma	C2398
PTS1	List	182
NHS (N-Hydroxysuccinimide)	Pierce	24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)	Thermo Scientific	22981
Ethanolamine	Sigma	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
Anti-CTA antibody	Santa Cruz Biotech	sc-80747
Anti-CTB antibody	Calbiochem	227040
Anti-PTS1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-57639
Refractometer	Reichert	SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides	Reichert	13206060
Syringe pump	Cole Palmer	780200C