Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l'enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux

Summary

Ce protocole vidéo démontre une nouvelle méthode pour la génération et la purification ultérieure des cellules progénitrices neuronales à partir d'une source renouvelable de cellules souches neurales (CSN) en fonction de leur physique (taille et granularité interne) et les propriétés fluorescentes en utilisant la technologie de cytométrie en flux.

Abstract

Les cellules souches neurales (CSN) peuvent être isolés et élargi à grande échelle, en utilisant le test neurosphères et différenciés dans les trois principaux types de cellules du système nerveux central (SNC); à savoir, les astrocytes, oligodendrocytes et des neurones. Ces caractéristiques font de souches neurales et les cellules progénitrices une source inestimable renouvelable de cellules pour des études in vitro, tels que le dépistage des drogues, neurotoxicologie et l'électrophysiologie et aussi pour la thérapie de remplacement cellulaire dans de nombreuses maladies neurologiques. En pratique, cependant, l'hétérogénéité de la descendance NSC, la faible production de neurones et des oligodendrocytes, les astrocytes et la prédominance de la suite de différenciation limiter leurs applications cliniques. Ici, nous décrivons une nouvelle méthodologie pour la purification de production et subséquente des neurones immatures de NSC descendance murin utilisant la fluorescence tri cellulaire (FACS) de la technologie. En utilisant cette méthodologie, une population hautement enrichi de cellules souches neuronales peuvent être atteints d'espritHout toute astrocytes notable et de bonne foi la contamination NSC. La procédure comprend la différenciation des produits de filiation du NSC isolé et agrandi à partir de E14 éminences ganglionnaires de souris en utilisant le test neurosphères, suivie par l'isolement et l'enrichissement de cellules immatures neuronaux en fonction de leurs propriétés physiques (taille et la complexité interne) et fluorescente utilisant la technologie de cytométrie en flux. Dans l'ensemble, cela prend 5-7 jours pour générer neurosphères et 6-8 jours pour différencier descendance NSC et d'isoler hautement purifié des cellules neuronales immatures.

Protocol

1. Basic Set Up Avant de procéder à la culture cellulaire NeuroCult NSC milieu de base et les suppléments NeuroCult NSC prolifération sont mélangés à un rapport 9:1, respectivement, de faire du milieu complet NSC. Un bain à 37 ° C est utilisée pour réchauffer le milieu. Quantité appropriée de inactivé par la chaleur sérum de veau foetal (FCS) est décongelé. Quantité appropriée de solutions d'achat d'actions du facteur de croissance, y compris le facteur…

Discussion

La capacité d'isoler des populations définies de cellules neurales (neurones à savoir, astrocytes et oligodendrocytes) pourrait résoudre certains des obstacles associés à l'application clinique des cellules souches neurales (CSN). Tout d'abord, il nous permet de caractériser complètement la population de départ de cellules du donneur. Deuxièmement, il nous permet d'utiliser un type cellulaire particulier ou une combinaison de différents types de cellules avec un rapport spécifique, en fonctio…

Materials

Name of the reagent	Type	Company	Catalogue number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05    trypsin-EDTA	Reagent	Gibco	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma	T6522
Pen/Strep	Reagent	Gibco	15140-122
*MEM	Reagent	Gibco	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	Gibco	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Falcon	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352070
EGF	Growth factor	R&D	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma	H4784	Reconstituted in PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Antibody	Miltenyi Biotec	130-093-274
PE- Conjugated mouse IgG1	Isotype control antibody	BD Pharminogen	556029
Heparin	Growth factor	Sigma	H4784	Reconstituted in PBS
HrBMP-4	Growth factor	R&D	314-BP-010
Poly-L-Ornithine	Reagent	Sigma	P4957
Fetal Calf Serum	Medium Supplement	Gibco	10099-141
GFAP	Antibody	DAKO	Z0334
B-III tubulin	Antibody	Promega	G7121

*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.