De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie
Summary
Deze video protocol geeft blijk van een nieuwe methode voor het genereren en daaropvolgende zuivering van neuronale stamcellen uit een hernieuwbare bron van neurale stamcellen (NSC) op basis van hun fysieke (grootte en interne granulariteit) en fluorescerende eigenschappen met behulp van flowcytometrie-technologie.
Abstract
Neurale stamcellen (NSC), kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in op grote schaal, met behulp van de neurosphere test en gedifferentieerd in de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel (CZS), namelijk, astrocyten, oligodendrocyten en neuronen. Deze eigenschappen maken neurale stamcellen en stamcellen een waardevolle hernieuwbare bron van cellen voor in vitro studies zoals drug discovery, neurotoxicology en electrofysiologie en ook voor celvervangingstherapie in veel neurologische aandoeningen. In de praktijk echter, heterogeniteit van NSC nakomelingen, lage productie van neuronen en oligodendrocyten, en overheersing van astrocyten na differentiatie beperken hun klinische toepassingen. Hier wordt beschreven een nieuwe methode voor de productie en daaropvolgende zuivering van onvolwassen neuronen van knaagdier NSC nakomelingen met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) technologie. Met behulp van deze methode kan een zeer verrijkt neuronale voorlopercellen celpopulatie worden bereikt witHout merkbare astrocyten en bonafide NSC besmetting. De procedure omvat differentiatie van NSC nakomelingen geïsoleerd en uitgebreid van E14 muis ganglion grootheden met behulp van de neurosphere test, gevolgd door isolatie en verrijking van onrijpe neuronale cellen op basis van hun fysieke (grootte en interne complexiteit) en fluorescerende eigenschappen met behulp van flowcytometrie-technologie. Over het algemeen duurt het 5-7 dagen tot neurospheres en 6-8 dagen genereren om NSC nakomelingen differentiëren en te isoleren in hoge mate gezuiverd onvolwassen neuronale cellen.
Protocol
Discussion
De mogelijkheid om bepaalde neurale celpopulaties te isoleren (dat wil zeggen neuronen, astrocyten en oligodendrocyten) kunnen oplossen van enkele van de belemmeringen in verband met de klinische toepassing van neurale stamcellen (NSC). Ten eerste kunnen we het volledig karakteriseren van het begin bevolking van donor cellen. Ten tweede kunnen we een bepaald celtype of een combinatie van verschillende celtypes gebruikt met een specifieke verhouding afhankelijk van de aard of fase van de ziekte. Ten slotte kan het gebrui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiële steun van de Overstreet Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
