Fænotypisk analyse og isolering af murine hæmatopoietiske stamceller og Lineage-progenitorer
Summary
En fremgangsmåde til at analysere fordelingen af knoglemarvsceller hæmatopoietiske progenitorceller i flowcytometri samt effektivt isolere stærkt oprensede hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) er beskrevet. Isoleringsproceduren er hovedsagelig baseret på magnetisk berigelse af c-Kit +-celler og cellesortering at oprense HSC'er for cellulære og molekylære undersøgelser.
Abstract
Knoglemarven er det vigtigste sted, hvor HSC'er og mere modne blodceller afstamning progenitorer opholde sig og differentiere i en voksen organisme. HSC'er udgør et minut cellepopulation af pluripotente celler i stand til at generere alle blod cellelinier for et liv-tid 1. Den molekylære dissektion af HSC'er homeostase i knoglemarven har vigtige implikationer i bloddannelsen, onkologi og regenerativ medicin. Vi beskriver mærkning protokol med fluorescerende antistoffer og den elektroniske gating fremgangsmåden i flowcytometri scorer hæmatopoietiske progenitordelmængder og HSC'er distribution i individuelle mus (Fig. 1). Derudover beskriver vi en metode til omfattende berige hæmatopoietiske stamfædre såvel som på lang sigt (LT) og kortsigtede (ST) rekonstituering HSC'er fra sammenlagte knoglemarv cellesuspensioner ved magnetisk berigelse af celler, der udtrykker c-Kit. Den resulterende celle præparat kan anvendes til at sortere udvalgt delmængder til in vitro ogin vivo funktionelle studier (fig. 2).
Begge trabekulære osteoblaster 2,3 og sinusformet endotel 4 udgør funktionelle nicher understøtter HSC'er i knoglemarven. Adskillige mekanismer i osteoblastisk niche, herunder en delmængde af N-cadherin + osteoblaster 3 og vekselvirkning af receptor-tyrosinkinase Tie2 udtrykt i HSC'er med dets ligand angiopoietin-1 5 deler at bestemme HSC'er hviletilstand. "Dvale" i knoglemarven er afgørende for at beskytte HSC'er fra replikation og eventuel udmattelse ved overdreven cykling aktivitet 6. Exogene stimuli, der virker på celler i det medfødte immunsystem, såsom Toll-lignende receptorligander 7 og interferon-a 6 kan også inducere proliferation og differentiation af HSC'er i linietilknyttede progenitorer. For nylig, en befolkning på hvilende mus HSC'er i Lin – c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 – CD34 – befolkningen er blevet beskrevet 8. Sortering af celler baseret på CD34-ekspression fra det hæmatopoietiske progenitorer-berigede cellesuspension som beskrevet her tillader isolering af både hvilende selvfornyende LT-HSC'er og ST-HSC'er 9. En lignende procedure baseret på depletering af afstamningsceller positive celler og sortering af LT-HSC med CD48 og Flk2 antistoffer er tidligere blevet beskrevet 10. I nærværende rapport tilvejebringer vi en protokol for den fænotypiske karakterisering og ex vivo cellecyklusanalyse af hæmatopoietiske progenitorceller, som kan være nyttige til overvågning af hæmatopoiese i forskellige fysiologiske og patologiske tilstande. Desuden beskriver vi en FACS-sortering procedure HSC'er, som kan anvendes til at definere faktorer og mekanismer, der regulerer deres selvfornyelse, ekspansion og differentiering cellebiologi og signaltransduktion assays samt til transplantation.
Protocol
Discussion
Den her beskrevne fremgangsmåde muliggør hurtig og nøjagtig analyse af hæmatopoiese i individuelle mus (figur 1). Denne analyse i forskellige eksperimentelle indstillinger, herunder murine modeller med inflammation, autoimmunitet og immundeficiens, degenerative sygdomme, metaboliske sygdomme og cancer, tillader at behandle virkningerne af patologiske tilstande på hæmopoiesis. Figur 3 viser analysen af cellecyklus aktivitet på elektronisk styrede LKS CD34 –…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa og Markus Manz for værdifulde råd. Dette arbejde blev finansieret af den schweiziske National Science Foundation, schweizisk Cancer League og Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, . Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
