Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon
Summary
Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.
Abstract
Kemik iliği HKH'ler ve daha olgun kan hücrelerinin soy ataları ikamet ve yetişkin bir organizmanın bir farklılaşmanın temel sitedir. HKH'lerin ömür boyu 1 için tüm kan hücre soylarının yaratabilmeleridir pluripotent hücrelerin bir dakika hücre popülasyonu oluşturmaktadır. Kemik iliğindeki HKH'ler homeostazının moleküler diseksiyonu hematopoezisi, onkoloji ve rejeneratif tıp açısından önemli olmaktadır. Biz floresan antikor ve bireysel farelerde hematopoetik progenitör alt ve HKH'lerin dağılımı (Şekil 1) puan almak için akım sitometri içinde elektronik yolluk prosedürü ile etiketleme protokolü tanımlar. Ayrıca, yaygın hematopoietik öncü yanı sıra uzun vadeli (LT) ve c-Kit eksprese eden hücrelerin manyetik zenginleştirme tarafından toplanan kemik iliği hücre süspansiyonları gelen HKH'ler yeniden yapılandırılması kısa vadeli (ST) zenginleştirmek için bir metodu tanımlar. Elde edilen hücre hazırlanması için in vitro olarak seçilen alt sıralamak ve etmek için kullanılabilirİn vivo çalışmalar işlevsel (Şekil 2).
Hem trabeküler osteoblastlar 2,3 ve sinüzoidal endotel 4 kemik iliğinde HKH'ler destekleyen fonksiyonel niş oluşturmaktadır. N-kaderin + osteoblastlar 3 alt ve ligand anjiyopoietin-1 5 ile HKH'ler ifade reseptör tirozin kinaz Tie2 etkileşimi de dahil olmak üzere osteoblastik niş içinde çeşitli mekanizmalar HKH'ler sessizliğini belirlenmesinde hemfikir. Kemik iliğinde "Hazırda" aşırı bisiklet aktivitesi üzerine 6 çoğaltma ve sonunda yorgunluktan HKH'ler korumak için çok önemlidir. Böyle Toll-like reseptör ligandlar 7 ve interferon-α 6 gibi doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinde etkili eksojen uyarılara da soyu adamış ataları içine yayılması ve HKH'lerin ayrımı uyarabilir. Son zamanlarda, lin içinde uyuyan fare HKH'ler nüfusu – c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 – CD34 – nüfusu 8 tarif edilmiştir. Hücrelerin Sıralama burada açıklandığı gibi hematopoietik öncü zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu ile CD34 ekspresyonunun dayalı sağlar sakin kendini yenileyen LT-HKH'ler ve ST-HKH'ler 9 hem de izolasyon. Soyu pozitif hücrelerinin tükenmesine ve CD48 ve Flk2 antikorları ile birlikte LT-KYH sıralama göre benzer bir prosedür, daha önce 10 tarif edilmiştir. Bu yazıda fenotipik karakterizasyonu ve farklı fizyolojik ve patolojik şartlarda hematopoez izlemek için yararlı olabilir hematopoietik öncü, ex vivo hücre döngüsü analizi için bir protokol sağlar. Ayrıca, biz faktörleri ve hücre biyolojisi ve sinyal iletimi deneyleri yanı sıra transplantasyon için kendi kendini yenileme, genişleme ve farklılaşma düzenleyen mekanizmaları tanımlamak için kullanılabilir HKH'ler, prosedürü sıralama bir FACS açıklar.
Protocol
Discussion
Burada anlatılan yöntem tek tek fareleri (Şekil 1) in hematopoiesis hızlı ve doğru analizine olanak tanır. Fare inflamasyon modelleri, otoimmünite, immün yetmezlik, dejeneratif hastalıklar, metabolik hastalıklar ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli deneysel ayarları, bu analiz hematopoiezis patolojik durumun etkisini ele veriyor. Şekil 3 elektronik kapılı LKS üzerinde hücre bisiklet aktivitesi analizini gösterir CD34 – Ki-67 mab ve DAPI ile…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz değerli tavsiye için Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa ve Markus Manz teşekkür ederiz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, İsviçre Kanser Ligi ve Fondazione Ticinese başına la RIcerca sul Cancro tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, . Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
