Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre
Summary
En metode for å analysere fordelingen av benmarg blodkreft stamfedre i flowcytometri samt å effektivt isolere høyrenset blodkreft stamceller (HSCs) er beskrevet. Isolasjonen prosedyren er hovedsakelig basert på magnetisk anrikning av c-Kit + celler og celle sortering for å rense HSCs for cellulære og molekylære studier.
Abstract
Benmargen er det viktigste stedet der HSCs og mer modne blodceller avstamning stamfedre bor og differensiere i en voksen organisme. HSCs utgjør et minutt celle populasjon av pluripotent celler i stand til å generere alle blodceller linjene for en levetid 1. Den molekylære disseksjon av HSCs homeostase i benmargen har viktige implikasjoner i hematopoiesis, onkologi og regenerativ medisin. Vi beskriver merking protokollen med fluorescerende antistoffer og det elektroniske gating prosedyren i flowcytometri å score blodkreft progenitor undergrupper og HSCs distribusjon i enkelte mus (Fig. 1). I tillegg beskriver vi en metode for å utstrekning berike blodkreft stamfedre samt langsiktig (LT) og kortsiktige (ST) rekonstituering HSCs fra sammenslåtte benmarg cellesuspensjoner av magnetisk anrikning av celler uttrykker c-Kit. Den resulterende celleforberedelsen kan brukes til å sortere utvalgte undergrupper for in vitro ogin vivo funksjonelle studier (Fig. 2).
Begge trabekulært osteoblaster 2,3 og sinusformet endotelet 4 utgjør funksjonelle nisjer støtter HSCs i benmargen. Flere mekanismer i osteoblastaktivitet nisje, blant en undergruppe av N-cadherin + osteoblaster 3 og samhandling av reseptoren tyrosin kinase Tie2 uttrykt i HSCs med sin ligand angiopoietin-1 5 enig i å bestemme HSCs quiescence. "Dvale" i benmargen er avgjørende for å beskytte HSCs fra replikering og eventuell utmattelse ved overdreven sykling aktivitet seks. Eksogene stimuli som virker på cellene i det medfødte immunsystemet som Toll-like receptor ligander 7 og interferon-alfa 6 kan også indusere proliferasjon og differensiering av HSCs inn avstamning engasjerte stamfedre. Nylig har en befolkning på sovende mus HSCs innenfor LIN – c-Kit + SCA-1 + CD150 + CD48 – CD34 – befolkningen har blitt beskrevet åtte. Sortering av celler basert på CD34 uttrykk fra hematopoetiske stamceller-beriket cellesuspensjon som beskrevet her tillater isolering av både stillestående selv fornye LT-HSCs og ST-HSCs 9. En lignende prosedyre basert på nedbryting av avstamning positive celler og sortering av LT-HSC med CD48 og Flk2 antistoffer har vært beskrevet tidligere 10. I den foreliggende rapporten gir vi en protokoll for fenotypisk karakterisering og ex vivo cellesyklus analyse av hematopoetiske stamceller, som kan være nyttig for å overvåke hematopoiesis i ulike fysiologiske og patologiske forhold. Videre beskriver vi en FACS sortering prosedyre for HSCs, som kan brukes til å definere faktorer og mekanismer som regulerer deres selvfornyelse, ekspansjon og differensiering i cellebiologi og signaltransduksjon analyser så vel som for transplantasjon.
Protocol
Discussion
Metoden beskrevet her muliggjør rask og nøyaktig analyse av hematopoiesis i enkelte mus (figur 1). Denne analysen i ulike eksperimentelle innstillinger, inkludert murine modeller av betennelse, autoimmunitet, immunsvikt, degenerative sykdommer, metabolske forstyrrelser og kreft, kan ta opp virkningen av patologiske tilstander på hematopoiesis. Figur 3 viser analysen av cellen sykling aktivitet på elektronisk gated LKS CD34 – celler fra friske mus og mus med i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa og Markus Manz for dyrebare råd. Dette arbeidet ble finansiert av det sveitsiske National Science Foundation, sveitsiske Cancer League og Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, . Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
