TransFLP - en metod för att genetiskt modifiera<em> Vibrio cholerae</em> Baserad på naturliga Transformation och FLP-rekombination
Summary
En snabb metod för att modifiera genomet hos<em> V. cholerae</em> Beskrives. Dessa modifieringar omfattar borttagning av enstaka gener, kluster genen och genomiska öar samt integration av korta sekvenser (t.ex. promotorelement eller affinitet-tag sekvenser). Metoden är baserad på den naturliga omvandlingen och FLP-rekombination.
Abstract
Flera metoder finns tillgängliga för att manipulera bakteriella kromosomer 1-3. De flesta av dessa protokoll förlitar sig på införandet av villkorligt replikativa plasmider (t.ex. hyser PIR-beroende eller temperaturkänsliga replikoner 1,2). Dessa plasmider integreras i bakteriella kromosomer baserat på homologi-medierad rekombination. Sådana insertionsmutationen mutanter ofta används direkt i experimentella inställningar. Alternativt kan välja för plasmid excision följt av dess förlust göras, vilket för gramnegativa bakterier ofta förlitar sig på mot-valbara levan sukras enzym som kodas av sacB-genen 4. Excision kan antingen återställa före infogning genotyp eller resultera i ett utbyte mellan kromosomen och plasmiden-kodad kopia av den modifierade genen. En nackdel med denna teknik är att det är tidskrävande. Plasmiden måste klonas först, det kräver horisontell överföring till V. cholerae (mest N otably genom parning med ett E. E. coli-stam donator) eller artificiell omvandling av den senare, och excision av plasmiden är slumpmässig och kan antingen återställa den ursprungliga genotypen eller skapa den önskade ändringen, om någon positiv selektion utövas. Här presenterar vi en metod för snabb hantering av V. cholerae-kromosomen (er) 5 (Figur 1). Denna TransFLP metod är baserad på den nyligen upptäckta kitin-medierad induktion av naturlig kompetens denna organism 6 och annan företrädare för släktet Vibrio som V. fischeri 7. Naturlig kompetens möjliggör upptaget av fritt DNA, inklusive PCR-genererade DNA-fragment. När tas upp, rekombinerar DNA med kromosomen eftersom närvaron av minst 250-500 bp flankerande homologa regionen 8. Inklusive en selektionsmarkör in mellan dessa flankerande regionerna gör det lätt att upptäcka vanligt förekommande transformanter.
t "> Denna metod kan användas för olika genetiska manipulationer av V. cholerae och eventuellt även andra naturligt kompetenta bakterier. Vi erbjuder tre nya exempel på vad som kan åstadkommas med denna metod utöver vår tidigare publicerad studie på enstaka gen strykningar och tillsättning av affinitet-tag sekvenser 5. Flera optimering steg om inledande protokollet av kitin-inducerad naturlig omvandling 6 ingår i denna TransFLP protokoll. inkluderar bland annat utbyte av fragment krabba skal av kommersiellt tillgänglig kitin flingor 8, donation av PCR Dessa -härledd DNA som transformerande materialet 9, och tillsatsen av FLP-rekombinationsställen målställen (FRT) 5. FRT-ställen kan sätesriktad excision av selektionsmarkören förmedlas av FLP-rekombinas 10.Protocol
Representative Results
Discussion
Den TransFLP metod som beskrivits ovan och på andra ställen 5 utsträckning har använts i vårt laboratorium. Den typ av genetiska manipulationer som är genomförbara inkluderar bland annat: deletion av enskilda gener och kluster genprodukter, deletion av genomiska öar (t.ex. VPI-1), insättning av sekvenser uppströms om en gen av intresse (t.ex., promotorsekvenser) och insättning av sekvenser vid slutet av en specifik gen (t.ex. kodar affinitetsmarkörer).
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jag skulle vilja erkänna Olga de Souza Silva för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (SNSF) Grant 31003A_127029.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
- Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
- Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
- Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
- De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
- Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
- Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
- Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. . Molecular Cloning: A laboratory manual. 1, (1989).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
- Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
- Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
- Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
- Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani, M., Kamruzzaman, J. J., Mekalanos, Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
- Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
- Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).
