TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem<em> Vibrio cholerae</em> Doğal Dönüşüm ve FLP-rekombinasyon sonucu
Summary
Arasında genomunu değiştirmeye hızlı bir yöntem<em> V. cholerae</em> Tarif edilmektedir. Bu değişiklikler tek genlerin, gen kümeleri ve genomik adaları gibi kısa dizileri (örn. promotor elemanlarına veya benzeşim-etiket dizileri) ve entegrasyon silme içerir. Yöntem, doğal transformasyon ve FLP-rekombinasyon dayanmaktadır.
Abstract
Çeşitli yöntemler bakteri kromozomu 1-3 işlemek için kullanılabilir. Bu protokollerin çoğu (örneğin, pir-bağımlı veya ısıya duyarlı Replikon 1,2 yataklık) şartlı replikatif plazmid ekleme güveniyor. Bu plazmid homoloji-aracılı rekombinasyon bazlı bakteri kromozomu içine entegre edilmiştir. Bu tür mutantlar insersiyonal çoğu kez direkt olarak deney ortamlarda kullanılır. Alternatif olarak, onun kaybı, ardından plazmid çıkarılması için seçim sık sık SACB gen tarafından kodlanan 4 karşı tarafından seçilebilir levan sukraz enzimi dayanır Gram-negatif bakteriler için, hangi gerçekleştirilebilir. Eksizyonu ya da ön-yerleştirme genotip ya da kromozom ve modifiye geninin plazmid ile kodlanmış kopya arasında bir değişim ile sonuçlanır geri olabilir. Bu yöntemin bir dezavantajı, zaman alıcı olmasıdır. Plazmid ilk klonlanmış gerekmektedir; bunu V. içine yatay transferi gerektirir cholerae (en fazla n otably E ile çiftleştirilerek coli suşu verici) ya da ikinci bir yapay dönüştürülmesi; ve plazmid eksizyonu ve rasgele ya da ilk genotip geri ya da herhangi bir pozitif seçim sarf edilir ise, istenen değişikliği oluşturabilir. Burada, V. hızlı manipülasyon için bir yöntem mevcut cholerae kromozom (lar) 5 (Şekil 1). Bu TransFLP yöntem, V. gibi cins Vibrio bu organizmanın 6 ve diğer temsilci doğal yetkinlik yeni keşfedilen kitin-aracılı indüksiyon dayanmaktadır fischeri 7. Doğal yetkinlik PCR tarafından oluşturulan DNA parçaları dahil olmak üzere ücretsiz DNA alımını sağlar. Bir kez alınır, DNA homolog bölgenin 8 sınırdaş 250-500 bp asgari varlığını verilen kromozomu ile yeniden birleştirilmesi kastedilmektedir. Bu komşu bölgeleri arasındaki bir seçim işaretleyici İçeren sık görülen transformantlar kolay algılanmasını sağlar.
T "> Bu yöntem, V. cholerae, farklı genetik manipülasyonu için kullanılabilir ve potansiyel olarak da diğer doğal olarak yeterli bakteri olabilir. bizim daha önce yayınlanmış bir gen silme üzerinde çalışma ve ek olarak, bu yöntem tarafından gerçekleştirilebilir ne üç yeni örnekler sağlamak benzerlik etiketlenmesi sekansları 5 ek. kitin kaynaklı doğal dönüşüm 6 başlangıç protokolünü ilgili birçok iyileştirme adımlar bu TransFLP protokol içinde bu buluşa katılmıştır. Bunlar, diğerlerinin arasında ticari olarak mevcut kitin pul 8, PCR tarafından yardım yengeç kabuk parçalarından replasman, madde 9, ve FLP-rekombinasyon hedef sitesi (FRT) 5 transforme ilave olarak türetilmiş DNA. FRT sitesi FLP rekombinaz 10 tarafından aracılık seçim işaretleyicinin her bölge-yönlendirmeli eksizyon izin verir.Protocol
Representative Results
Discussion
TransFLP yöntemi 5 yoğun laboratuarımızda kullanılmıştır yukarıda ve yerde anlatılmıştır. Mümkün olan genetik manipülasyon tür diğerlerinin yanı sıra şunları içerir: tek genler ve gen kümelerinin silinmesi, genomik adalar silme (örn., VPI-1), ilgilenilen bir gen (örneğin, promoter dizileri) yukarı akış yönünde dizilerin yerleştirilmesi ve ekleme , belirli bir gen (örneğin, kodlama afinite etiketleri) sonunda dizileri.
T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ben teknik yardım için Olga de Souza Silva kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) Hibe 31003A_127029 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
- Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
- Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
- Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
- De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
- Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
- Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
- Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. . Molecular Cloning: A laboratory manual. 1, (1989).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
- Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
- Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
- Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
- Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani, M., Kamruzzaman, J. J., Mekalanos, Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
- Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
- Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).
