GC מבוסס זיהוי של אצטט חומצה Aldononitrile גלוקוזאמין Muramic Derivatized לקביעת שאריות מיקרוביאלית בקרקע
Summary
אנו מתארים את שיטת פרוטוקול ניתוח GC מבוסס על אצטט נגזרים aldonitrile של גלוקוזאמין וחומצה muramic שחולצו מן הקרקע. עבור הבהרה של מנגנון כימי, יש לנו גם להציג את האסטרטגיה כדי לאשר את המבנה של נגזרת ואת שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים.
Abstract
גישות כמותית מיקרואורגניזמים המאפיינים הם בעלי חשיבות קריטית להבנה רחבה יותר של מצב תפקוד מיקרוביאלי ובתוך מערכות אקולוגיות. האסטרטגיות הקיימות כיום עבור ניתוח חיידקים כוללים הן מסורתיות תרבות תלויי מעבדה טכניקות אלה המבוססים על מיצוי ישיר וקביעת סמנים מסוימים 1, 2. מעטים בקרב מגוון של מינים של חיידקים המאכלסים אדמה יכול להיות מתורבת, כך תלויי תרבות שיטות להציג הטיות משמעותיות, מגבלה נעדר בניתוח סמן ביולוגי.
חומצה גלוקוזאמין, mannosamine, galactosamine ו muramic כבר שימש גם אמצעי של החיים וגם המוני חיידקים מתים, חומצה גלוקוזאמין (הנפוץ ביותר) ו muramic אלה (ייחודי של תא החיידק) הם המרכיבים החשובים ביותר במערכות אדמה 3 , 4. עם זאת, חוסר ידע על ניתוח מגביל פופולריזציה רחב בקרב בני גילם מדעיים. בין כל exiהעוקץ שיטות אנליטיות, derivatization כדי aldononitrile acetates ואחריו ניתוח GC מבוסס התפתחה אפשרות טובה מבחינת איזון אופטימלי דיוק, רגישות, פשטות, ההפרדה chromatographic טובה, יציבות על אחסון מדגם 5.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח אמין ופשוט יחסית של גלוקוזאמין וחומצה muramic מהקרקע לאחר ההמרה שלהם acetates aldononitrile. פרוטוקול בעיקר כוללת ארבעה שלבים: חומצה העיכול, טיהור המדגם, derivatization ונחישות GC. הליך צעד אחר צעד הוא שונה על פי פרסומים בעבר 6, 7. בנוסף, אנו מציגים אסטרטגיה מבנית לאמת את יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה נוצר על יינון אלקטרונים. אנחנו מוחלים GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS ו ריאגנטים שכותרתו isotopically כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized ו מורחומצה amic, היינו שינוי המסה של איזוטופ, שכותרתו נגזרים בספקטרום יון לחקור שברי יון של כל אחד נגזרים 8. בנוסף להבהרה תיאורטית, אימות של יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה יהיה שימושי לחוקרים באמצעות δ 13 C או שברי יון של סמנים אלה במחקרים biogeochemical 9, 10.
Protocol
Discussion
הציג GC מבוססת השיטה לניתוח אצטט חומצה aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized מספק שיטה מהירה יחסית לכמת אלה אמינו, סוכרים המופקים אדמה. הנגזרים הם יציבים מבחינה כימית, וכן ניתן לקבוע בניתוח אחד. השיטה אינה מצטמצמת אך דגימות קרקע, והוא יכול להיות פשוט יותר עבור דגימות של מטריקס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים DOE הימות הגדולות Bioenergy מרכז המחקר (DOE BER משרד המדע DE-FC02-07ER64494). אנו מודים לד"ר Xudong זאנג חברי הקבוצה שלו לדיונים טכניים מועילות והערות שלא יסולא בפז על השלמת פרוטוקול.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 |
| Methanol (dry) | Acros organics | AC326950010 |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros organics | AC148270050 |
| Ethyl acetate | VWR International | BJGC100-4 |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros organics | AC174670050 |
| D-glucose-U-13C | Cambridge isotope lab | CLM-1396-1 |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge isotope lab | NLM-713-1 |
| Name of the equipment | Company | Type |
| Rapid-Vap | LabConco | 790002 |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. . Assessment Methods for Soil Carbon. , 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars – a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
