GC на основе обнаружения Aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой для определения микробной остатков в почве
Summary
Мы описываем метод протокола для GC на основе анализа aldonitrile ацетат производных глюкозамина и мурамовой кислота извлекается из почвы. Для выяснения химического механизма, мы также представляем стратегию, чтобы подтвердить структуру производной и ионов фрагментов, образующихся при ионизации электрона.
Abstract
Количественный подход к описанию микроорганизмов имеют решающее значение для более глубокого понимания микробной статус и функции в экосистемах. Современные стратегии для микробной анализа включают в себя как традиционные лаборатории культуры зависит от техники и те, которые основаны на прямых добычи и определение определенных биомаркеров 1, 2. Немногие среди разнообразия микробных видов, обитающих в почве может быть культурным, так культура зависит от метода внедрения значительных смещений, ограничение отсутствует в биомаркеров анализа.
Глюкозамин, mannosamine, галактозамина и мурамовой кислоты, хорошо служили в качестве меры живых и мертвых масса микробов, из них глюкозамин (наиболее распространенный) и мурамовой кислоты (единственным из бактериальной клетки) являются наиболее важными составляющими в почве системы 3 , 4. Тем не менее, отсутствие знаний по анализу ограничивает широкой популяризации среди научных коллег. Среди всех Exiжалить аналитических методов, производных для aldononitrile ацетаты затем GC-анализа стала хорошим выбором в отношении оптимального баланса точность, чувствительность, простоту, хороший хроматографического разделения и стабильности на хранение образец 5.
Здесь мы представляем подробный протокол для надежной и сравнительно простой анализ глюкозамин и мурамовой кислоту из почвы после их преобразования в aldononitrile ацетаты. Протокол в основном состоит из четырех этапов: кислотного разложения, образец очистки, производных и GC определения. Шаг за шагом процедуры изменение в соответствии с бывшими публикаций 6, 7. Кроме того, мы представляем стратегию структурной проверки молекулярного иона производная и ее фрагментов ион образуется при ионизации электрона. Мы обратились GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS и изотопно-меченых реагентов для определения молекулярной массы aldononitrile ацетат производные глюкозамина и мурАМИК кислоты, мы использовали массовый переход изотопно-меченых производных в ионных спектра для исследования ионных фрагментов каждого производные 8. В дополнение к теоретическому выяснению, проверка молекулярного иона производного и его фрагменты иона будет полезной для исследователей, использующих δ 13 С или ионно фрагменты этих биомаркеров в биогеохимических исследований 9, 10.
Protocol
Discussion
Представленные GC-метод, основанный на анализе aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой обеспечивает относительно быстрый метод количественной оценки этих аминосахаров, извлеченных из почвы. Производных химически стабильны, и могут быть определены в одном анализе. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Министерства энергетики Великих озер биоэнергетики научно-исследовательский центр (DOE BER офис науки DE-FC02-07ER64494). Мы благодарны доктору Сюйдун Чжан и его членов группы за полезные обсуждения технических вопросов и бесценные комментарии по доработке протокола.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 |
| Methanol (dry) | Acros organics | AC326950010 |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros organics | AC148270050 |
| Ethyl acetate | VWR International | BJGC100-4 |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros organics | AC174670050 |
| D-glucose-U-13C | Cambridge isotope lab | CLM-1396-1 |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge isotope lab | NLM-713-1 |
| Name of the equipment | Company | Type |
| Rapid-Vap | LabConco | 790002 |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. . Assessment Methods for Soil Carbon. , 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars – a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
