GC-baseret detektion af Aldononitrile Acetat Derivatiseret Glucosamin og Muramic Acid for Mikrobiel Rest bestemmelse i jord
Summary
Beskriver vi en fremgangsmåde protokol for GC-analyse af aldonitrile acetat derivater af glucosamin og muramic syre ekstraheret fra jord. Til belysning af den kemiske mekanisme også præsenteres en strategi for at bekræfte strukturen af derivatet og ion-fragmenterne dannet ved elektron ionisering.
Abstract
Kvantitative metoder til at karakterisere mikroorganismer er afgørende for en bredere forståelse af den mikrobielle status og funktion i økosystemerne. Aktuelle strategier for mikrobiel analyse omfatter både traditionelle laboratorie kultur-afhængige teknikker og de er baseret på direkte udvinding og bestemmelse af visse biomarkører 1, 2. Få blandt mangfoldigheden af mikrobielle arter bebo jorden kan dyrkes, så kultur-afhængige metoder medføre store afvigelser, en begrænsning fraværende i biomarkør analyse.
Den glucosamin, mannosamin, galactosamin og muramic syre er blevet godt tjent som foranstaltninger af både levende og døde mikrobiel masse af disse glucosamin (hyppigst forekommende) og muramic syre (unik fra bakteriecellen) er de vigtigste bestanddele i jorden systemerne 3 , 4. Men manglende viden om analysen begrænser den brede popularization mellem videnskabelige jævnaldrende. Blandt alle existikke analysemetoder, derivatisering til aldononitrile acetater efterfulgt af GC-analyse har vist sig som en god mulighed for med hensyn til optimalt afbalancere præcision, følsomhed, enkelhed, god kromatografisk separation, og stabilitet ved prøveopbevaringsperioden 5.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for en pålidelig og relativt enkel analyse af glucosamin og muramic syre fra jorden efter deres konvertering til aldononitrile acetater. Protokollen hovedsageligt består af fire trin: syre fordøjelse, prøve rensning, derivatisering og GC beslutsomhed. Den trin-for-trin procedure er modificeret i henhold til tidligere publikationer 6, 7. Desuden præsenterer vi en strategi for strukturelt validere molekylære ion af derivatet og dets ion-fragmenter dannet ved elektron ionisering. Vi anvendte GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS og isotopisk mærkede reagenser til bestemmelse af molekylvægten af aldononitrile acetat derivatiseret glucosamin og muramidsyre, anvendte vi massen forskydning af isotop-mærkede derivater af ion-spektret til at undersøge ion fragmenter af hver derivater 8. Ud over den teoretiske belysningen vil validering af molekylære ion af derivatet og ion-fragmenter være nyttigt at forskere ved hjælp δ 13C eller ion fragmenter af disse biomarkører i biogeokemiske undersøgelser 9, 10.
Protocol
Discussion
Den fremlagte GC-metode til analyse af aldononitrile acetat derivatiserede glucosamin og muramic syre giver en relativt hurtig metode til at kvantificere disse aminosukkere, udvundet af jord. De derivater er kemisk stabile, og kan bestemmes i en analyse. Metoden er ikke begrænset til jordprøver og kan forenkles for prøver fra ikke-jord matrix.
Vakuumpumpen anvendes i denne fremgangsmåde er designet til at være modstandsdygtig over for syre. Vi foreslog endvidere, at oprette en base fæl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra DOE Great Lakes i Bioenergi Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494). Vi er taknemmelige for Dr. Xudong Zhang og hans gruppe medlemmer til nyttige tekniske drøftelser og uvurderlige Bemærkninger til færdiggørelsen af protokollen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 |
| Methanol (dry) | Acros organics | AC326950010 |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros organics | AC148270050 |
| Ethyl acetate | VWR International | BJGC100-4 |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros organics | AC174670050 |
| D-glucose-U-13C | Cambridge isotope lab | CLM-1396-1 |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge isotope lab | NLM-713-1 |
| Name of the equipment | Company | Type |
| Rapid-Vap | LabConco | 790002 |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. . Assessment Methods for Soil Carbon. , 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars – a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
