מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Summary

Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin כמה<em> ב subtilis</em> Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry הזרימה.

Abstract

היווצרות biofilm היא תכונה כללית כמעט כל ^1-6 חיידקים. כאשר חיידקים ליצור biofilms, תאים נארזים תאי מטריקס כי היא היוותה בעיקר על ידי חלבונים exopolysaccharides, בין היתר ^7-10. קהילת חיידקים עטוף בתוך biofilm לעיתים קרובות ניתן לראות את הבידול של subpopulation מובהק של תאים מיוחדים ^11-17. Subpopulations אלה לדור בכפיפה אחת, ולעתים קרובות להראות ארגון במרחב ובזמן בתוך biofilm ^18-21.

היווצרות biofilm ב האורגניזם subtilis מודל בצילוס דורש בידול של subpopulations שונים של תאים מיוחדים. ביניהם, subpopulation של מפיקי מטריקס, אחראי לייצר ולהפריש תאי מטריקס של biofilm הוא חיוני ליצירת biofilm ^11,19. לפיכך, בידול של מפיקי מטריקס היא סימן ההיכר של היווצרות biofilm ב B. subtilis.

השתמשנו כתבים ניאון כדי לחזות ולכמת subpopulation של מפיקי מטריקס ב biofilms של B. subtilis ^15,19,22-24. באופן קונקרטי, יש לנו ציין כי subpopulation של מפיקי מטריקס מבדיל בתגובה לנוכחות של האות בהפקה עצמית תאי surfactin ^25. מעניין, surfactin מופק על ידי subpopulation של תאים מיוחדים שונים subpopulation של מפיקי מטריקס ^15.

הפרדנו בדוח זה גישה טכנית צורך לדמיין ולכמת subpopulation של מפיקי מטריקס ומפיקים surfactin בתוך biofilms של subtilis ב. לשם כך, כתבים ניאון של הגנים הדרושים לייצור מטריקס ייצור surfactin מוכנסים לתוך כרומוזום של B. subtilis. עיתונאים באים לידי ביטוי רק subpopulation של תאים מיוחדים. לאחר מכן, subpopulations יכולים להיותמעקב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי cytometry זרימה (ראה איור 1).

העובדה subpopulations שונים של תאים מיוחדים לדור בכפיפה אחת בתוך הקהילות תאיים של חיידקים נותן לנו נקודת מבט שונה על רגולציה של ביטוי גנים פרוקריוטים. פרוטוקול זה מטפל בתופעה בניסוי וניתן להתאים בקלות כל מודל עבודה אחר, כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההטרוגניות פנוטיפי בתוך קהילה של חיידקים.

Protocol

1. סימון ב ' subtilis היווצרות assay biofilm להגביר ידי PCR את האזור המקדם של הגן של עניין. אנחנו מראים כדוגמא שיבוט של P טאפה, האמרגן של הגנים האחראים על ייצור של חלבון מטריקס טסה 26. Clone P טאפה לתוך ו…

Discussion

העובדה קהילות חיידקי להראות subpopulations של תאים המבטאים קבוצה מסוימת של ראיות גנים המורכבות של קהילות מיקרוביאלי ^33,34. פרוטוקול זה אמור לעזור לקבוע אם הביטוי של הגן בכל עניין מוגבל subpopulation מסוים של תאים מיוחדים בתוך הקהילה של חיידקים. ויזואליזציה של subpopulations אלה מחי?…

Materials

Technique	Name of the reagent	Company	Catalog number
MSgg composition	potassium phosphate 5mM	Roth	6878
	MOPS 100mM	Sigma-Aldrich	M1254
	Magnesium chloride 2mM	Roth	2189.1
	Calcium chloride 700μM	Roth	A119.1
	Ferric chloride 50μM	Sigma-Aldrich	157740
	Zinc chloride 1μM	Applichem	A2076
	Thiamine 2μM	Sigma-Aldrich	74625
	Glycerol 0.5%	Roth	7533
	Glutamate 0.5%	Sigma-Aldrich	49621
	Tryptophan 50μg/ml	Sigma-Aldrich	T0254
	Phenylalanine 50μg/ml	Sigma-Aldrich	P2126
Cell fixation	Paraformaldehyde	Roth	0335
	Name of the equipment	Company	Catalog number
Sonication	Cell Sonicator	Bandelin	D-1000
Fluorescence Microscopy	Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000B
	Name of the software	Company	Catalog Number
Fluorescence Microscopy	AsaF	Leica
Flow cytometry	FCASDiva	BD
Flow cytometry	FlowJo	Treestar