Kolesterol akışı Testi
Summary
Kolesterol tahlilini kültürü hücrelerinden kolesterol akışı hızı ve hücreler serbest kolesterol kabul plazma alıcısının kapasitesi ölçmek için tasarlanmıştır. Tahlil içi havuzu ve ekstrasellüler alıcı için kolesterol serbest bırakılması arasında kolesterol kolesterol, denge ile hücrelerin etiketlenmesi oluşur.
Abstract
Hücrelerin kolesterol içeriği hücre zarının bozulması, apoptoz ve nekroz 1 bir hücreye sonuçları çok fazla veya çok az kolesterol, çok dar sınırlar içinde tutulmalıdır. Hücreler hücre içi sentezi ve plazma lipoprotein kaynak kolesterol, hem de kaynakları tamamen kolesterol için hücrelerin ihtiyaçlarını karşılamak için yeterli olabilir. Kolesterol sentezi ve alım süreçleri sıkı regüle ve kolesterol eksikliği azdır 2 olarak uygulanır. Aşırı kolesterol daha yaygın sorun 3'tür. Hepatositlerin dışında ve bir dereceye adrenokortikal hücrelere, hücreler kolesterol düşmesine edemiyoruz. Hücreler kendi kolesterol miktarını azaltmak için iki seçeneğiniz var: aynı zamanda toksik kolesterol esterleri ile hücrelerin aşırı olarak kolesterol esterleri, sınırlı kapasiteli bir seçenek haline dönüştürmek kolesterol ve kolesterol akışı, potansiyel olarak sınırsız kapasiteye sahip bir seçenek. Kolesterol akışı bir specBöyle ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı proteinler A1 (ABCA1) ve G1 (ABCG1) ve çöpçü reseptör tip B1 gibi hücre içi nakliyeciler, bir dizi ile düzenlenmiştir IFIC süreci. Plazma kolesterol doğal alıcı yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) ve apolipoprotein AI olduğunu.
Kolesterol akışı assay kültürü hücrelerinden kolesterol akışı oranı ölçmek için tasarlanmıştır. Bu kolesterol akışı ve / veya hücre serbest kolesterol kabul plazma alıcıları kapasitesini korumak için hücre kapasitesi ölçer. Deneyi aşağıdaki adımlardan oluşur. Adım 1: serum içeren orta etiketli kolesterol ekleme ve 24-48 saat hücreleri ile kuluçkaya hücresel kolesterol etiketleme. Bu adımda kolesterol hücrelerinin yüklenmesi ile kombine edilebilir. Adım 2: bütün hücre içi kolesterol havuzlarına etiketli kolesterol dengelenmeye serum içermeyen aracı madde içinde hücrelerinin inkübasyon. Bu aşamada hücresel kanal aktivasyonu ile kombine edilebilirolesterol taşımacıları. Adım 3: ekstraselüler alıcı ve hücreler arası alıcı için etiketli kolesterol hareketinin kantitatif sahip hücrelerin inkübasyon. Kolesterol öncüleri yeni sentezlenen kolesterol etiketlemek için kullanılması durumunda, bir dördüncü aşama, kolesterol saflaştırma, gerekli olabilir.
Deneyi aşağıdaki bilgi sağlar: (i) belirli bir işlem (a mutasyonu, bir itici, aşağı, bir aşırı ekspresyonu ya da tedavi) efflux kolesterol hücre kapasitesi etkiler ve (ii) nasıl plazma alıcısının kapasitesi kolesterol kabul nasıl Bir hastalık veya bir tedavi tarafından etkilenir. Bu yöntem, çoğu zaman kardiyovasküler araştırmalar, metabolik ve nörodejeneratif hastalıklar, bulaşıcı hastalıklar ve üreme bağlamında kullanılır.
Protocol
Discussion
Kolesterol akışı ölçmek için açıklanan yönteme hücreleri bir hücre dışı kolesterol alıcı için kolesterol hareketinin ölçülmesi için tasarlanmıştır. Bu metodoloji anlamada çok önemli hususlar vardır.
Etiketleme ve alışım
Tarif metodolojide etiketli kolesterol serumu içeren serum ilave edilir. Ayrıntılı olarak incelenmiştir asla rağmen, kolesterol serum lipoprotein içine dahil edilmiştir ve hücreleri tarafından alınmasını kab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Victoria Hükümeti'nin OIS Programı tarafından Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (526.615 ve 545.906) gelen ve kısmen hibe ile desteklenmiştir. DS NHMRC bir üyesidir.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
|||||
| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
|||||
References
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer’s bottle to Scap’s MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
- Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
- Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
- Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
- Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
- D’Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
- Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
- Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
- Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).
- Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
- Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
- Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
- Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).
