Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis
Summary
Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.
Abstract
Zelluläre Bewegung in Reaktion auf externe Stimuli ist von grundlegender Bedeutung für viele zelluläre Prozesse einschließlich Wundheilung, Entzündung und der Reaktion auf eine Infektion. Eine übliche Methode zur Chemotaxis messen, ist die Boyden-Kammer, in die Zellen und für chemische Lockstoffe durch eine poröse Membran getrennt sind. Wenn Zellen durch die Membran in Richtung der Lockstoff migrieren, sie an der Unterseite der Membran, oder fallen in die darunter liegenden Media zu halten, und anschließend gefärbt und visuell gezählt 1. Bei diesem Verfahren werden die Zellen in einem steilen Gradienten und vorübergehend für chemische Lockstoffe, die vermutlich eine schlechte Darstellung von Gradienten in Geweben 2 fanden sein ausgesetzt ist.
Ein weiterer Assay-System, das unter Agarose-Chemotaxis-Assay, 3, 4 Maßnahmen Zellbewegung über ein festes Substrat in einem dünnen flüssigen Film, der unter dem Agarose-Schicht bildet. Die Steigung, die in der Agarose entwickelt ist flach und wird gedacht, um eine App seinlich und sinnvoll Darstellung von natürlich vorkommenden Steigungen. Chemotaxis kann durch mikroskopische Abbildung der Strecke ausgewertet werden. Sowohl der Boyden-Kammer Assay und der unter-Agarose-Assay werden meist als Endpunkt-Assays konfiguriert.
Die automatisierte ECIS / Taxis System kombiniert die unter-Agarose-Ansatz mit Elektro-Zell-Substrat-Impedanzabtastung (ECIS) 5, 6. In diesem Assay werden Ziel-Elektroden in jeder von 8 Kammern. Eine große Gegenelektrode fließt durch jeden der 8 Kammern (2). Jede Kammer ist mit Agarose gefüllt und zwei kleine Vertiefungen sind die Senkung der Agarose auf beiden Seiten der Zielelektrode. Eine Vertiefung wird mit dem Test-Zellpopulation gefüllt, während die andere enthält die Quellen des Diffundierens chemoattraktive (Abbildung 3). Der Strom durch das System geleitet werden verwendet, um die Änderung des Widerstands, die als Zellen über die Zielelektrode übergeben tritt zu bestimmen. Die Zellen auf dem Ziel electrode um den Widerstand des Systems 6. Darüber hinaus vertreten schnellen Schwankungen im Widerstand Änderungen bei den Wechselwirkungen von Zellen mit der Elektrodenoberfläche und deuten auf anhaltende zelluläre Form ändert. Die ECIS / Taxis kann messen Bewegung des Zellpopulation in Echtzeit über längere Zeit, sondern auch empfindlich genug, um die Ankunft einer einzelnen Zelle in der Target-Elektrode zu erfassen.
Dictyostelium discoidium ist bekannt, dass in der Gegenwart eines Folat-Gradienten 7, 8 und die chemotaktische Reaktion lässt sich durch ECIS / Taxis 9 gemessen werden migrieren. Leukozyten Chemotaxis, als Reaktion auf SDF1α und Chemotaxis-Antagonisten können auch mit ECIS / Taxis 10, 11 gemessen. Ein Beispiel für die Leukozyten Reaktion auf SDF1α ist in 1 gezeigt.
Protocol
Discussion
Neuartige Merkmale des ECIS / Taxis Assay in seiner Fähigkeit, die Sammlung von Daten in Echtzeit zu automatisieren, wenn die Zellen für chemische Lockstoffe reagieren. Während die banalsten Anwendung dieser Technologie ist es, zelluläre Antworten auf individuelle chemotaktischen Gradienten zu messen, oder an Steigungen von Mischungen von Chemotaxis Agonisten und-Antagonisten umfasst, ist die ECIS / Taxis Ansatz auch zugänglich für Abweichungen von diesen Konfigurationen, die sehr hilfreich sein in der EU noch Beu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health (ES07408 und EB00208) unterstützt.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Molecular Applications | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Laboratory Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
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