माउस भ्रूण fibroblast कोशिकाओं संवर्धन मानव भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के लिए उपयुक्त की तैयारी

Summary

माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) के गुणवत्ता CF-1 के रूप में माउस का सही तनाव से निर्धारित होता है. Pluripotency सहायक MEFs और वातानुकूलित मीडिया (मुख्यमंत्री) इन से प्राप्त सह operatively आत्म नवीकरण और pluripotency बनाए रखने के लिए इष्टतम Activin एक, Gremlin और Tgfβ1 के की सांद्रता Activin / नोडल FGF और रास्ते के लिए आवश्यक शामिल करना चाहिए.

Abstract

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)¹ can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.

The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium². Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs³. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)⁴. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions^5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established⁸.

To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells⁹, adult skin cells¹⁰, foreskin fibroblasts^11-12, amniotic mesenchymal cells¹³). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A¹⁴. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.

Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgfβ1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs^15-16.

For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.

Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

Protocol

1. माउस भ्रूणीय Fibroblasts के अलगाव (MEFs) निम्नलिखित दो कदम गैर – सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं. गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था से 13 या 14 डीपीसी (दिन बाद coitum). पर एक गर्भवती माउस (CF1, Harlan, संयुक्त राज्य अमेरिका) बलिदान. गर्भाशय सींग काटना, संक्षेप में एक बाज़ सीए 2 + मिलीग्राम 2 के बिना पीबीएस युक्त ट्यूब में 70 (v / v)% इथेनॉल और जगह में कुल्ला + (Gibco, Invitrogen) निम्न चरणों का पालन एक ऊतक संस्कृति हुड में किया जाता है और सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत बाँझ उपकरणों का उपयोग. एक पेट्री डिश में गर्भाशय सींग प्लेस और अपने नाल और भ्रूण थैली से प्रत्येक भ्रूण अलग. सिर और लाल अंगों काटना, पीबीएस में धोने और एक साफ पेट्री डिश में सभी भ्रूण जगह. सूक्ष्मता एक बाँझ धार का उपयोग कर जब तक यह संभव हो जाता है विंदुक ऊतक क़ीमा. 0.05% की 1 मिलीलीटर जोड़ें trypsin / (Gibco, Invitrogen) EDTA, incluडिंग DNase मैं (यूएसबी) 100 Kunitz भ्रूण के प्रति, इकाइयों. एक 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में ऊतक स्थानांतरण और 37 पर 15 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन प्रत्येक 5 मिनट के बाद, pipetting और नीचे अच्छी तरह से कोशिकाओं को अलग कर देना. 1 हौसले से तैयार MEF मध्यम मात्रा के बारे में जोड़कर trypsin निष्क्रिय. MEF संस्कृति मध्यम (घटक बनाने के लिए मीडिया के 500 मिलीलीटर, सभी घटकों और फिल्टर मिश्रण): DMEM की 450 मिलीलीटर, FBS की 50 मिलीग्राम (10% (v / v)), 200 एल glutamine मिमी (1/100 (v / v)) 5 मिलीग्राम, पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन की 5 मिलीलीटर (1/100 (v v /)). अपकेंद्रित्र कम गति (300 XG), 5 मिनट के साथ कोशिकाओं, ध्यान से गर्म MEF मध्यम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली निकाल दें. थाली लगभग कक्षों की एक संख्या है जो प्रत्येक T150 कुप्पी (TPP) में 3-4 भ्रूण 2 घंटे के लिए 0.2% (गोजातीय त्वचा, प्रकार बी, सिग्मा से जिलेटिन) जिलेटिन के साथ लेपित के लिए बराबर है. fibroblasts (P0, 0 बीतने) के केवल कोशिकाओं कि जिलेटिन लेपित बोतल को संलग्न करने की क्षमता है. </lमैं> आदर्श रूप में, कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद 80-90% सहधारा कर रहे हैं और इस स्तर पर P0 कोशिकाओं का एक प्रमुख हिस्सा भविष्य में उपयोग के लिए जमे हुए है. पी 3 या पी 4 तक P0 कोशिकाओं के शेष T150 कुप्पी (ओं) का विस्तार करें, तो निष्क्रिय और उपयोग के रूप में भक्षण hESCs replate या वातानुकूलित मध्यम (मुख्यमंत्री) का उत्पादन. 2. निष्क्रियता और चढ़ाना MEFs (फीडर कक्ष तैयार) सभी कदम बाहर एक ऊतक संस्कृति हुड में सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत किया जाता है. 0.2% जिलेटिन और कम से कम 2 घंटे के लिए सेते हैं आरटी के साथ T150 बोतल कोट. पीबीएस में mitomycin सी (1 मिलीग्राम / एमएल) और फिल्टर पतला. MEFs से मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और 2 Ca + 2 मिलीग्राम + बिना पीबीएस के साथ धो. 10 μg / MEFs पर mitomycin सी मिलीग्राम से युक्त मध्यम की जगह 20 मिली. 37 पर 2 घंटे के लिए सेते हैं ° सी mitomycin सी के साथ मध्यम युक्त तो Pbs, trypsinize, अपकेंद्रित्र (300 XG में 5 मिनट के लिए) और गर्म माध्यम resuspend कोशिकाओं के साथ दो बार धोना. 56.000 कोशिकाओं / T150 बोतल में 2 सेमी की एक घनत्व कोशिकाओं और थाली गिनती और निम्नलिखित 6 दिनों के लिए मुख्यमंत्री के उत्पादन के लिए उपयोग करें. 3. वातानुकूलित मध्यम तैयार (मुख्यमंत्री) सभी कदम बाहर एक ऊतक संस्कृति हुड में सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत किया जाता है. 56.000 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक घनत्व पर निष्क्रिय MEFs चढ़ाना hESC मध्यम (उम, असुविधाजनक मध्यम) (0.5 मिलीग्राम / 2 सेमी) के साथ MEF मध्यम बदलने के बाद दिन 4 एनजी / FGF2 की मिलीलीटर के साथ हौसले से पूरक. 24 घंटे ऊष्मायन के बाद फीडर बोतल से मुख्यमंत्री लीजिए और ताजा hESC 4 एनजी / FGF2 का भक्षण करने के लिए मिलीग्राम से युक्त मध्यम जोड़ें. अगले 6 दिनों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. प्रत्येक दिन दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर मुख्यमंत्री एकत्र 6 दिन के बाद मध्यम और फिल्टर (Corning, 0.22 माइक्रोन, पीए) के सभी aliquots मिश्रण. -80 में 50 मिलीलीटर aliquots और दुकान बनाने डिग्री सेल्सियस Matrigel पर हो hESCs को जोड़ने से पहले अतिरिक्त 4 एनजी / FGF2 की मिलीग्राम के साथ मुख्यमंत्री अनुपूरक <./ Li> 4. वातानुकूलित मीडिया Activin का मापन (एलिसा) 15 सभी नमूनों और अभिकर्मकों कमरे के तापमान को लाओ. पतला प्रतिरक्षी (मानव \ माउस \ चूहा Activin एमएबी, सिस्टम अनुसंधान एवं विकास) पर कब्जा पीबीएस में 1% BSA के साथ, microplate करने के लिए जोड़ने (100 μl अच्छी तरह /) और आरटी पर रातोंरात सेते हैं. 24 घंटे के बाद कुओं PBST (0.05% के बीच 20 के साथ पीबीएस) (300 μl / अच्छी तरह से) के साथ तीन बार तो धो आरटी में 1 घंटे के लिए ब्लॉक (1% / BSA PBS, 300 / μl अच्छी तरह से). इस समय में एक Activin एक (आर एंड डी सिस्टम) 7 (एकाग्रता कम से कम 30 एनजी / एमएल) dilutions और खाली नमूना सहित मानक वक्र, तैयार करते हैं. Activin रैखिक काम सीमा 0.25 के बीच और 32 एनजी / मिली है. कुओं (100 μl /) के मानकों और नमूने के डुप्लिकेट और आरटी में 2 घंटे के लिए सेते हैं. कुओं धो तीन बार (300 PBST की μl). माध्यमिक (biotinylated) (ह्यूमन / माउस / चूहा Activin एक, एमएबी, अनुसंधान एवं विकास सिस्टम Biotinylated) एंटीबॉडी (0 जोड़ें.25 μg /% 1 / BSA पीबीएस में मिलीलीटर) और आर टी में 2 घंटे के लिए सेते हैं. कुओं धो तीन बार (300 PBST की μl), streptavidin एचआरपी (1% BSA / Pbs, अनुसंधान एवं विकास प्रणाली में पतला) जोड़ने और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. कुओं धो तीन बार (300 PBST की μl), सब्सट्रेट समाधान की 100 μl (Quantikine, सिस्टम आर एंड डी) को जोड़ने और आरटी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं. प्रत्येक अच्छी तरह से रोकने के समाधान के लिए 100 μl (Quantikine, सिस्टम आर एंड डी) को जोड़ें और धीरे मिश्रण. सेट Microplate 450 एनएम के लिए (आण्विक उपकरण स्पेक्ट्रा 250 मैक्स, वैश्विक चिकित्सा उपकरण, Inc, मिनेसोटा) 540 या 570 एनएम के तरंग दैर्ध्य सुधार, प्रत्येक के ऑप्टिकल घनत्व अच्छी तरह से निर्धारित के साथ, पाठक. 5. प्रतिनिधि परिणाम अलगाव प्रक्रिया की समग्र योजना चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. hESCs और अलग अलग परिस्थितियों में सभ्य hiPSCs के ठेठ morphology चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है. की आकारिकी MEFs और निष्क्रिय फीडर मुख्यमंत्री को तैयार किया कोशिकाओं चित्रा 3 में प्रस्तुत किया है. सामान्य में, कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद अलगाव मिला हुआ और जमे हुए या विस्तारित किया जा करने के लिए तैयार होना चाहिए. हालांकि, 2-3 दिनों कभी कभी यह मिला हुआ संस्कृतियों को प्राप्त करने से पहले ले सकता है. मुख्यमंत्री 4 मार्ग और नहीं बाद में कोशिकाओं से तैयार किया जाना चाहिए. यह महत्वपूर्ण है क्योंकि प्राथमिक कोशिकाओं senescence की शुरुआत से पहले ही 4-5 मार्ग के लिए विस्तारित किया जा. साइटोकाइन के, Activin एक, फीडर कोशिकाओं द्वारा secreted है pluripotent 14 कोशिकाओं के undifferentiated वृद्धि के समर्थन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक के रूप में माना जाता है. की माप मुख्यमंत्री में Activin का स्तर (चित्रा 4) एक बहुत ही सुविधाजनक मात्रात्मक परख के लिए MEFs की गुणवत्ता की निगरानी है. चित्रा 1 MEFs अलगाव प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. "ontent> चित्रा 2. Undifferentiated (ए) फीडर कोशिकाओं, वातानुकूलित मध्यम (बी) और (सी) परिभाषित मध्यम की उपस्थिति में संवर्धित hESCs के ठेठ morphology. (डी, ई) फीडर कोशिकाओं की उपस्थिति में संवर्धित hiPSCs की ठेठ morphology. चित्रा 3. माउस भ्रूण fibroblasts की ठेठ आकारिकी (MEFs) के (ए) 0 (P0) चढ़ाना / अलगाव के बाद दो दिन, (बी) 56.000 कोशिकाओं / सेमी की एक घनत्व पर निष्क्रिय फीडर परत 2. पारित चित्रा 4 एनजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) आधारित वातानुकूलित (मुख्यमंत्री) मध्यम जनसंपर्क में Activin की एकाग्रता की माप.माउस भ्रूण CF1 माउस तनाव से व्युत्पन्न fibroblasts साथ epared. मुख्यमंत्री 6 दिनों के लिए एकत्र किया गया था और फिर जमा. मुख्यमंत्री "1" और मुख्यमंत्री "2" मीडिया और असुविधाजनक मीडिया के लिए उम के विभिन्न बैचों के लिए देखें. कंडीशनिंग प्रक्रिया के समारोह के रूप में मध्यम में MEFs, Activin के द्वारा एक स्राव Activin एक उम में लगभग undetectable है.

Discussion

MEFs अलगाव यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया hESCs और hiPSCs के लिए एक मानकीकृत संस्कृति हालत की स्थापना के लिए सक्षम बनाता है. इसके अलावा एलिसा – आधारित प्रणाली फीडर कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन का मूल्यांकन किया MEF व्युत्पन्न वातानुकूलित मीडिया की गुणवत्ता का एक उपयोगी सूचक है. माउस (CF1) के तनाव समर्थन fibroblasts प्रदान करने के नियमित रखरखाव संस्कृति मीडिया के बदलाव बैच बैच से बचने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, यह कई चूहों से भ्रूण को अलग एक साथ कोशिकाओं के अनुरूप गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है. निश्चित रूप से हौसले से अलग MEFs रखा जा सकता है P0 और P1 पर जमे हुए है. भी निष्क्रिय MEFs रखा जाना उचित मात्रा में सेल संस्कृति के लिए आवश्यकताओं के आधार पर की aliquots में जम कर सकते हैं. आमतौर पर लगभग 250.000 कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से प्लेट की संस्कृति hESCs और आईपीएस कोशिकाओं को एक एकल अच्छी तरह से में चढ़ाया जाना चाहिए. स्थापित और अनुकूलित विधि नियमित diffe के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैप्रयोगों किराया.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM (High Glucose)	Gibco, Invitrogen	41966-052
FBS	Biochrom	S0115
L-glutamine	Gibco, Invitrogen	25030-024
Penicillin-streptomycin	Gibco, Invitrogen	15140-122
Vacuum filter system	Corning	431097	500 ml, 0.22 μm, PAS
DMSO	Sigma	D2650
Knockout DMEM	Gibco, Invitrogen	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco, Invitrogen	10828-028
Non-Essential Amino Acids	Gibco, Invitrogen	11140-035
beta-Mercaptoethanol	Sigma	M7522
PBS	Gibco, Invitrogen	14190-169
DNase I	Sigma	D4527
Mitomycin C	Roche	10107409001
Basic Fibroblast Growth Factor	PeproTech	100-18B
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody	R&D Systems	BAM3381
Gelatin	Sigma	G9391
Human/Mouse/Rat Activin A MAb	R&D Systems	MAB3381
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco, Invitrogen	25300-054
Extra Thin Iris Scissors	FST	14088-10
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10
Pierse Fixation Forceps	FST	18155-13