Dyrkning og anvendelse af Roterende Wall Vessel bioreaktor Afledt 3D epitelcelletyper modeller
Summary
Et roterende cellekultur, der tillader epitelceller til at vokse under fysiologiske betingelser, hvilket resulterer i 3-D cellulær aggregatdannelse er beskrevet. Aggregaterne dannes display<em> In vivo</em>-Lignende egenskaber, ikke er observeret i traditionelle kultur modeller og tjene som et mere præcist organotypiske modelsystem for en lang række videnskabelige undersøgelser.
Abstract
Celler og væv i kroppen oplevelse miljømæssige forhold, der påvirker deres arkitektur, intercellulære kommunikation, og overordnede funktioner. Til in vitro cellekulturmodeller nøjagtigt at efterligne vævet af interesse, vækstmiljø af kulturen er et kritisk aspekt at overveje. Almindeligt anvendte konventionelle cellekultursystemer udbreder epitelceller på flade todimensionale (2D) uigennemtrængelige overflader. Selvom vi har lært meget fra konventionelle celledyrkningssystemer, mange fund er ikke reproduceres i humane kliniske undersøgelser eller vævseksplantater, muligvis som følge af manglen på en fysiologisk relevant mikromiljø.
Her beskriver vi en kultur, der overvinder mange af de dyrkningsbetingelse grænser 2-D cellekulturer ved hjælp af den innovative roterende væg beholder (RWV) bioreaktor teknologi. Vi og andre har vist, at organotypiske RWV-afledte modeller kan gentage struktue, funktion og autentiske menneskelige reaktioner på eksterne stimuli på samme måde til mennesker eksplantation væv 1-6. Den RWV bioreaktor er en suspensionskultur, der tillader vækst af epitelceller under lav fysiologisk væske forskydningsbetingelser. Bioreaktorerne kommer i to forskellige formater, en høj-aspekt roterende beholder (HARV) eller en langsom drejning lateral beholder (STLV), hvor de afviger fra deres beluftning kilde. Epitelceller tilsættes til bioreaktoren valg i kombination med porøse, collagen-overtrukne mikrobærerperler (figur 1A). Cellerne udnytte perlerne som en vækst stillads under konstant frie fald i bioreaktoren (fig. 1B). Mikromiljøet fra bioreaktoren tillader cellerne at danne tredimensionale (3D) aggregater viser in vivo-lignende karakteristika ofte ikke observeret under standard 2-D dyrkningsbetingelser (figur 1D). Disse egenskaber omfatter stramme vejkryds, MUCos produktion apikale / basal orientering in vivo protein lokalisering, og yderligere epitelcelle-typespecifikke egenskaber.
Progressionen fra et monolag af epitelceller til en fuldt differentieret 3-D aggregat varierer baseret på celletype 1, 7-13. Periodisk prøveudtagning fra bioreaktoren tillader overvågning af epitel aggregatdannelse, cellulære differentieringsmarkører og levedygtighed (figur 1D). Gang cellulær differentiering og aggregatdannelse er etableret, høstes cellerne fra bioreaktoren, og lignende assays udført på 2-D-celler kan anvendes til de 3-D aggregater med nogle aspekter (fig. 1E-G). I dette arbejde beskriver vi detaljerede trin hvordan kultur 3-D epitelcelletyper aggregater i RWV bioreaktoren og en række potentielle assays og analyser, der kan udføres med de 3-D aggregater. Disse analyser indbefatter, men er ikke begrænset til, strukturelle / morphological analyse (konfokal, scanning og transmissions elektron mikroskopi), cytokin / chemokinet sekretion og cellesignalering (cytometrisk perle array og Western blot-analyse), genekspression analyse (real-time PCR), toksikologiske / narkotika analyse og vært-patogen interaktioner. Anvendelsen af disse analyser lagt grunden til en mere dybdegående og omfattende undersøgelser, såsom metabolomics og transcriptomics, proteomics og andre array-baserede applikationer. Vores mål er at præsentere en ikke-konventionelle midler til dyrkning af humane epitelceller til at producere organotypiske 3-D modeller, der rekapitulerer den menneskelige in vivo væv, i en let og robust system, der skal bruges af forskere med forskellige videnskabelige interesser.
Protocol
Discussion
Udnyttelse af RWV bioreaktorteknologi præsenteret her kan give forskere mulighed for at fremme deres nuværende cellekultursystem til en mere fysiologisk relevant organotypisk cellekultur model. Den RWV Bioreaktoren cellekultursystem tilvejebringer en lav forskydning mikromiljø, der muliggør celler til dannelse af 3-D cellulære aggregater med in vivo-lignende egenskaber, herunder tight junctions og mucinproduktion og ekstracellulære processer (dvs. mikrovilli) og cellulære polaritet. Størstedele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Brooke Hjelm for hendes teknisk ekspertise og Andrew Larsen for sin protein analyse. Dette arbejde blev finansieret delvist af Alternatives Research Development Foundation (MMHK) Grant og NIH NIAID seksuelt overførte infektioner og aktuelt mikrobicider Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Vi takker for Biology of Reproduction for genbrug af tal.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
| PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O’Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O’Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
