إعداد الخلايا متعلق بالنخاع الشوكي المكثف المشتقة (MDSC) من الفئران الحاملة للورم ساذجة والبنكرياس باستخدام التدفق الخلوي والفرز الآلي المغناطيسي خلية المنشط (AutoMACS)
Summary
هذا هو أسلوب سريع وشامل للالمناعي الظاهري متعلق بالنخاع الشوكي الخلايا المشتقة المكثف (MDSC) وإثراء GR-1<sup> +</sup> الكريات البيض من الطحال الماوس. هذا الأسلوب يستخدم التدفق الخلوي والخلية AutoMACS الفرز لإثراء لقابلة للحياة 1 غرام<sup> +</sup> الكريات البيض قبل FACS فرز MDSC للاستخدام<em> في الجسم الحي</em> و<em> في المختبر</em> المقايسات.
Abstract
MDSC هي مجموعة من السكان غير متجانسة من غير ناضجة الضامة، الخلايا الجذعية والمحببة التي تتراكم في الأجهزة اللمفاوية في الحالات المرضية بما في ذلك العدوى الطفيلية، والالتهابات، الصدمة، مرض الطعم ضد المضيف والسكري والسرطان 1-7. في الفئران، MDSC صريحة ماك-1 (CD11b) وGR-1 (Ly6G وLy6C) مستضدات سطح 7. من المهم أن نلاحظ أن تدرس جيدا في MDSC المضيفين الحاملة للورم مختلف حيث يتم توسيع كبير هم وقمع المضادة للورم الاستجابات المناعية مقارنة مع نظرائهم من السذاجة 7-10. ومع ذلك، تبعا للحالة المرضية، وهناك مجموعات سكانية فرعية مختلفة من MDSC مع آليات متميزة وأهداف قمع 11،12. ولذلك، طرق فعالة لعزل السكان MDSC قابلة للحياة هي مهمة في توضيح الآليات الجزيئية المختلفة للقمع في التجارب المختبرية والحية.
في الآونة الأخيرة، ومجموعةوذكرت مجموعة hansah توسيع MDSC في نموذج سرطان البنكرياس الفئران. لدينا الحاملة للورم MDSC عرض فقدان التوازن، وزيادة وظيفة قمعية مقارنة MDSC ساذجة 13. النسب المئوية MDSC هي أقل بشكل ملحوظ في مقصورات اللمفاوية من الفئران السذاجة مقابل الورم الحاملة لل. وهذا هو التحذير الرئيسية، مما يعيق في كثير من الأحيان تحليلات مقارنة دقيقة لهذه MDSC. لذلك، وإثراء GR-1 + الكريات البيض من الفئران السذاجة قبل الإسفار الفرز خلية المنشط (FACS) يعزز نقاء، والسلامة، ويقلل كثيرا من الوقت نوع. ومع ذلك، والإثراء من الكريات البيض + GR-1 من الفئران الحاملة للورم هو اختياري لأن هذه هي في وفرة لنظام مراقبة الأصول الميدانية السريعة الفرز. ولذلك، في هذا البروتوكول، وصفنا أسلوبا كفاءة عالية من المناعي الظاهري MDSC وإثراء GR-1 + الكريات البيض من الطحال من الفئران ساذجة لفرز MDSC في الوقت المناسب. يتم تلقيح مناعيا C57BL / 6 الفئران مع اوربا Panc02 الفئرانLLS تحت الجلد في حين الفئران السذاجة تلقي 1XPBS. ما يقرب من 30 يوما بعد التلقيح، ويتم حصاد الطحال ومعالجتها إلى وحيدة الخلية تعليق باستخدام خلية تفكك غربال. ثم يتم Splenocytes خلايا الدم الحمراء (RBC) هي lysed وملطخة 1 قسامة من هذه الكريات البيض باستخدام ملون تألقي مترافق أجسام مضادة ضد ماك-1 و 1 غ إلى النسب المئوية نمط ظاهري مناعي MDSC باستخدام التدفق الخلوي. في تجربة موازية، وملطخة الكريات البيض كله من الفئران السذاجة مع الأجسام المضادة GR-1-مترافق فلوري، حضنت مع PE-MicroBeads واختيارها بصورة إيجابية باستخدام الفرز الآلي المغناطيسي خلية المنشط (autoMACS) برو فاصل. المقبل، وملطخة 1 قسامة من GR-1 الكريات البيض + مع الأجسام المضادة-1 ماك لتحديد الزيادة في نسب MDSC باستخدام التدفق الخلوي. الآن، وهذه الكريات البيض المخصب + GR1 مستعدون لنظام مراقبة الأصول الميدانية فرز MDSC لاستخدامها في تحليل مقارن (السذاجة مقابل الورم الحاملة لل) في في والمجراة في المختبر </EM> المقايسات.
Protocol
Discussion
هذه هي طريقة مفصلة لتجهيز وimmunophentyping السكان MDSC التي تنطبق على الأنسجة اللمفاوية المختلفة من مختلف النماذج الحيوانية. على وجه الخصوص، يمكن استخدام تخصيب autoMACS لعزل السكان الكريات البيض المختلفة بما في ذلك استنزاف-1 غرام من splenocytes 4، وتنقية الدم النخاعي من مجموعات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف التدفق الخلوي USF مرفق الأساسية. نود أن نشكر الدكتور دنيس كوبر لتقاسم الموارد. ونود أيضا أن نشكر مايا كوهين، بندلتون لورا لاتور وديانا لما قدموه من مساعدة في إعداد وتصوير هذا الفيديو. NN بدعم من جبهة الخلاص الوطني FG-LSAMP جسر لتنمية الموارد البشرية دكتوراه زمالة # 0929435. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الجمعية الأميركية للسرطان المؤسسية للبحوث غرانت # مركز السرطان 93-032-13/Moffitt منحت لTG.
Materials
| REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
| Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
| Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
| Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
| 70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
| 50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
| 5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
| 96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
| Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
| PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |
References
- Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
- Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
- Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
- Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
- Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
- Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
- Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
- Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
- Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
- Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
- Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
- Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
- Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
- Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
- Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
- Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
- Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
- Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
- Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).
