Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)

Summary

Este é um método rápido e abrangente de imunofenotipagem mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) e enriquecendo Gr-1⁺ Leucócitos a partir de baços de rato. Este método utiliza a citometria de fluxo e Cell AutoMACS classificação para enriquecer para viável Gr-1⁺ Leucócitos anteriores FACS de triagem de MDSC para uso<em> In vivo</em> E<em> In vitro</em> Ensaios.

Abstract

MDSC são uma população heterogénea de macrófagos, células dendríticas imaturas e granulócitos que se acumulam nos órgãos linfóides em condições patológicas, incluindo infecção por parasitas, inflamação, stress traumático, enxerto-versus-hospedeiro da doença, a diabetes eo cancro ^1-7. Em ratinhos, MDSC expressa Mac-1 (CD11b) e Gr-1 (Ly6G e Ly6C) antigénios de superfície ^7. É importante notar que MDSC são bem estudada em vários hospedeiros portadores de tumor, onde são significativamente expandidas e suprimir anti-tumorais respostas imunes homólogos em comparação com naive ^7-10. No entanto, dependendo do estado patológico, existem diferentes subpopulações de MDSC com mecanismos distintos e alvos de supressão ^11,12. Assim, os métodos eficazes para isolar populações viáveis ​​MDSC são importantes na elucidação suas diferentes mecanismos moleculares de supressão in vitro e in vivo.

Recentemente, o Ghansah grupo relatou a expansão do MDSC num modelo murino de pâncreas cancro. O nosso portadores de tumor MDSC exibir uma perda de homeostase e aumento da função supressora em comparação com MDSC ingénuos ^13. Percentagens MDSC são significativamente menos nos compartimentos linfóides de camundongos normais vs tumor-rolamento. Esta é uma ressalva importante, que muitas vezes dificulta precisas análises comparativas destes MDSC. Portanto, enriquecendo Gr-1 ⁺ leucócitos de camundongos ingênuos antes de separação de células activadas por fluorescência (FACS) fortalece a viabilidade, pureza e reduz significativamente o tempo de classificação. Todavia, o enriquecimento de Gr-1 ⁺ leucócitos de camundongos portadores de tumor é opcional uma vez que estes estão em abundância para FACS rápidas de classificação. Portanto, neste protocolo, nós descrevemos um método altamente eficiente de imunofenotipagem MDSC e enriquecendo ^Gr-1 + leucócitos de baços de camundongos normais para classificar MDSC em tempo hábil. Camundongos imunocompetentes C57BL / 6 são inoculadas com murino Panc02 cells subcutânea enquanto camundongos ingênuos receber 1XPBS. Aproximadamente 30 dias após a inoculação; baços são removidos e processados ​​em suspensões de célula única, utilizando uma célula de dissociação peneira. Os esplenócitos são então glóbulo vermelho (RBC) lisadas e uma alíquota destes leucócitos são coradas usando fluorocromo-anticorpos contra Mac-1 e Gr-1 a percentagens imunofenotipo MDSC utilizando citometria de fluxo. Numa experiência paralela, os leucócitos inteiras a partir de ratinhos naive são coradas com fluorescência conjugados Gr-1, incubados com anticorpos PE-micropérolas e positivamente seleccionadas utilizando uma separação de células automatizado Magnética Activado (autoMACS) Pro Separator. Em seguida, uma alíquota de ^Gr-1 + leucócitos são coradas com Mac-1 anticorpos para identificar o aumento em percentagem MDSC utilizando citometria de fluxo. Agora, estas GR1 ^leucócitos + enriquecidos estão prontos para a selecção de FACS MDSC para ser usado em análises comparativas (ingénuo vs portadores de tumor) em in vivo e in vitro </in> ensaios.

Protocol

Antes da partida, preparar as seguintes soluções: 3% de coloração Media (SM): -3% De soro fetal bovino (FBS) em 1X tampão fosfato salino (PBS) MACS buffer (MB): – 0,5% de albumina de Soro Bovino (BSA) em 1XPBS 1. Os baços de colheita de Ratos Por via subcutânea injectar 6-8 semanas de idade C57BL / 6 machos (Harlan) com 1,5 x 10 …

Discussion

Este é um método detalhado para o processamento e immunophentyping populações MDSC que é aplicável a diferentes tecidos linfóides a partir de vários modelos animais. Em particular, o enriquecimento autoMACS pode ser usado para o isolamento de várias populações de leucócitos, incluindo Gr-1 depleção de esplenócitos ^4, a purificação de subconjuntos mielóides de esplenócitos e gânglios linfáticos ^5, o isolamento dos neutrófilos da medula óssea ^{de 14} e purificação de…

Materials

REAGENT	COMPANY	CATALOG #	COMMENTS
1X Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC	eBiosciences	11-0112	Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC	eBiosciences	17-5931	Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE	eBiosciences	12-5931	Sterile Environment
DAPI	Invitrogen	D1306	Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve	Sigma-Aldrich	CD1-1KT	Autoclave before use
70-μm strainer	BD Biosciences	352350	Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer	eBiosciences	00-4333-57	Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-12	Sterile Environment
50ml conical tubes	Thermo Scientific	339652	Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes	BD Biosciences	352054	Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates	Corning	3897	Sterile Environment
Trypan Blue	Cellgro	25-900-CI	Sterile Environment
PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801	Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
AutoMACS Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221