Utarbeidelse av myeloide Bearbeidede suppressor celler (MDSC) fra naiv og bukspyttkjertelen Tumor-bærende mus med flowcytometrisystemer og Automated Magnetic Aktivert Cell Sorting (AutoMACS)
Summary
Dette er en rask og omfattende metode for immunfenotyping myelogen Avledede suppressor celler (MDSC) og berikende Gr-1<sup> +</sup> Leukocytter fra mus spleens. Denne metoden bruker flowcytometri og AutoMACS Cell Sortering å berike for levedyktige Gr-1<sup> +</sup> Leukocytter før FACS sortering av MDSC for bruk<em> In vivo</em> Og<em> In vitro</em> Analyser.
Abstract
MDSC er en heterogen befolkning umodne makrofager, dendrittiske celler og granulocytter som akkumuleres i lymfoide organer i patologiske tilstander, inkludert parasittisk infeksjon, betennelse, traumatisk stress, graft-versus-vert sykdom, diabetes og kreft 1-7. Hos mus, MDSC ekspress Mac-en (CD11b) og Gr-1 (Ly6G og Ly6C) overflateantigener 7. Det er viktig å merke seg at MDSC er godt studert i ulike tumor-bærende vertene hvor de er betydelig utvidet og undertrykke anti-tumor immunresponser sammenlignet med naive kolleger 7-10. Men avhengig av patologisk tilstand, er det forskjellige subpopulasjoner av MDSC med forskjellige mekanismer og delmål for undertrykkelse 11,12. Derfor, effektive metoder for å isolere levedyktige MDSC bestander er viktig i å forklare deres ulike molekylære mekanismer for undertrykkelse in vitro og in vivo.
Nylig, Ghansah gruppe har rapportert utvidelsen av MDSC i en murine bukspyttkjertelkreft modell. Vår tumor-bærende MDSC viser et tap av homeostase og økte undertrykkende funksjon i forhold til naive MDSC 13. MDSC prosenter er betydelig mindre i lymfoide avdelinger av naive vs tumor-bærende mus. Dette er en stor forbeholdet, som ofte hindrer nøyaktige komparative analyser av disse MDSC. Derfor berikende Gr-1 + leukocytter fra naive mus før Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) forbedrer renhet, levedyktighet og reduserer sortere tid. Imidlertid er anrikning av Gr-1 + leukocytter fra tumor-bærende mus valgfri da disse er i overflod for raske FACS sortering. Derfor, i denne protokollen, beskriver vi en svært effektiv metode for immunfenotyping MDSC og berikende Gr-1 + leukocytter fra spleens av naive mus for sortering MDSC på en riktig måte. Immunkompetente C57BL / 6 mus er inokulert med murine Panc02 ceLLS subkutant mens naive mus motta 1XPBS. Ca 30 dager etter inokulasjon; spleens høstes og bearbeides til encellede suspensjoner ved hjelp av en celle dissosiasjon sil. Splenocytes blir så røde blodceller (RBC) lysert og en delmengde av disse leukocytter er farget med fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer mot Mac-en og Gr-1 til immunophenotype MDSC prosenter ved hjelp av flowcytometri. I en parallell eksperiment, blir hele leukocytter fra naive mus farget med fluorescerende-konjugerte Gr-1 antistoffer, ruges med PE-MicroBeads og positivt valgt ved hjelp av en automatisert Magnetic Aktivert Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Deretter blir en delmengde av GR-1 + leukocytter farget med Mac-1 antistoffer for å identifisere økningen i MDSC prosenter ved hjelp av flowcytometri. Nå, disse GR1 + beriket leukocytter er klare for FACS sortering av MDSC skal brukes i komparative analyser (naivt vs tumor-bærende) i in vivo og in vitro </em> analyser.
Protocol
Discussion
Dette er en detaljert metode for å behandle og immunophentyping MDSC populasjoner som gjelder for ulike lymfevev fra ulike dyremodeller. Spesielt kan autoMACS berikelse brukes til isolering av ulike leukocytter populasjoner inkludert Gr-1 uttømming av splenocytes 4, rensing av myeloide undergrupper fra splenocytes og lymfeknuter 5, isolering av benmarg nøytrofile 14 og rensing av CD8 + T celler fra milt og lymfeknuter 15. Uavhengig av cellen befolkning av interes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner USF flowcytometrisystemer Kjerne Facility. Vi ønsker å takke Dr. Denise Cooper for å dele ressurser. Vi ønsker også å takke Maya Cohen, Laura Pendleton og Diana Latour for deres hjelp i å sette opp og filmingen av denne videoen. NN støttet av NSF FG-LSAMP Bridge til doktorgrad Fellowship HRD # 0929435. Dette arbeidet ble finansiert av American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center tildelt TG.
Materials
| REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
| Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
| Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
| Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
| 70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
| 50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
| 5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
| 96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
| Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
| PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |
References
- Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
- Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
- Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
- Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
- Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
- Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
- Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
- Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
- Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
- Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
- Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
- Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
- Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
- Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
- Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
- Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
- Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
- Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
- Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).
